Powerpoint 3 Flashcards
Requisitos de vetor ideal para transportar a ferramenta de modulação de DNA (por exemplo, shRNA, cDNA, CRISPR)
- Espaço suficiente para transportar grandes genes terapêuticos
- Alta eficiência de transdução / transfecção
- Capacidade de fornecer expressão estável e de longo prazo
- Inserir-se apenas nas células alvo específicas
- Evitar a inserção aleatória do gene terapêutico no genoma do hospedeiro
- Infetar células mitóticas, bem como células pós-mitóticas
- Capacidade de ser fabricado em grande escala
- Deve superar as barreiras extracelulares e intracelulares
Resumidamente, o vetor tem que ser: - - - -
- Funcional
- Duradouro
- Específico
- Seguro
-
- patogénico / imunogénico
- causar inflamação
Vantagens dos vetores virais:
- Pode ter como alvo tipos específicos de células
- Muito bom em alvejar e entrar nas células (alta eficiência de ‘entrada’)
- Podem ser modificados para que não se possam replicar e destruir células (partículas virais)
Desvantagens dos vetores virais:
- Alguns podem causar respostas imunológicas em pacientes
- Eles podem carregar uma quantidade limitada de material genético
- Maior custo de produção
O que são VLPs (viral-like particles)?
Vírus modificados, para não causarem doenças quando usados em pessoas
Mecanismo de ação dos retrovirus?
o RNA vira é convertido em DNA pelo trnascriptase reversa e depois é eficientemente integrado no genoma do hospedeiro
Para que são usados os retrovírus?
Introduzir genes novos ou alterados no genoma de células humanos e animai
Vetores retrovirais são usados amplamente para estudar:
Oncogenes e outros genes humanos
Lentivirus derivados do virus ____ tornaram-se as principais ferramentas para a entrega de genes em células de mamíferos
HIV-1
Qual e a característica vantajosa dos lentivirus?
Capacidade de mediar a transdução potente e a expressão estável em células em divisão e não divisão, tanto in vitro quanto in vivo.
Vantagens lentivírus:
- infetam tanto células em divisão como em não divisão
- Tropismo ampliado (tipo de células que podem infetar) pelo envelope VSV-G
- Expressão estável (podem integrar no genoma)
- não geram proteínas imunogénicas
- conseguem entregar fragmentos com até 9kb
Que 3 genes precisam de ser expressos nos lentivirus para permitir a produção de partículas lentivirais que carregam o gene?
- Gag: poliproteína
- Pol: transcriptase reversa
- Env: proteína do envelope
Em que células são normalmente produzidos os vetores/partículas lentivirais?
HEK 293T
- O “transfer plasmid” codifica:
- O “packaging plasmid” codifica:
- O “envelope plasmid” codifica:
- transgene + contém 3’ e 5’ LTRs essenciais à promoção da transcrição de um mRNA viral pela RNAPII + sequência psi que sinaliza o empacotamento do genoma
- genes necessários para a entrega e integração do genoma viral
- genes para proteínas de envelope
- O “transfer plasmid” codifica:
- O “packaging plasmid” codifica:
- O “envelope plasmid” codifica:
- transgene + contém 3’ e 5’ LTRs essenciais à promoção da transcrição de um mRNA viral pela RNAPII + sequência psi que sinaliza o “genoma packaging”
- genes necessários para a entrega e integração do genoma viral
- genes para proteínas do envelope
Vantagens dos adenovírus:
- Os vetores adenovirais têm alta eficiência de tradução;
- Capacidade de inserções de DNA de até 8 kb;
- Títulos (concentração) extremamente altos e infetam células em divisão e diferenciadas;
- Não se integram no genoma das células hospedeiras e não têm efeitos mutagênicos relacionados à inserção aleatória no genoma.
- Baixa imunogenicidade
Desvantagens dos adenovírus:
- Expressão transitória, uma vez que não estão integrados no genoma;
- Algumas proteínas virais ainda são expressas a partir do vetor adenoviral após a infeção do hospedeiro;
- Embora sua baixa imunogenicidade, os adenovírus são patógenos humanos comuns, e a infeção / transdução in vivo pode ser dificultada pela resposta imune do hospedeiro (problema potencial para terapia genética)
Vantagens de vetores não virias:
- Melhor perfil de segurança / menos imunogênico
- Menor custo de produção
Desvantagens de vetores não virias:
- Baixa eficiência de transfeção
- Captação celular difícil
- Fraca entrega direcionada
Desafios da terapia genética:
● Identificar e conhecer as células que necessitam de tratamento, o gene alvo, bem como os possíveis efeitos da modificação genética no seu metabolismo;
● Encontrar uma maneira de entregar os genes de maneira eficaz para o tipo específico de células e, se necessário, ativá-los de forma que permaneçam “ligados”
○ Problema: a incapacidade do DNA de passar pela membrana celular devido ao seu grande tamanho e carga negativa
○ O DNA terapêutico precisa escapar das endonucleases celulares e da depuração renal
● Garantir que os novos genes sejam precisamente controlados pelo corpo
● Vetores mediando alta eficiência de transfecção “in vitro” muitas vezes falham em alcançar resultados semelhantes “in vivo”
Vantagens da terapia genética:
- Potencial para eliminar e prevenir doenças hereditárias (fibrose cística, ADASCID, etc.).
- Possível cura para doenças do coração, AIDS e cancro.
- Pode ser usado para erradicar doenças das gerações futuras
Desvantagens da terapia genética:
- A terapia de longa duração pode não ser alcançada por terapia genética (em células que se dividem rapidamente)
- A resposta imune ao gene transferido estimula um risco potencial para a terapia genética.
- Distúrbios causados por defeitos em vários genes não podem ser tratados de forma eficaz com terapia genética
Problemas éticos da terapia genética:
- Quem terá acesso à terapia?
- Como podemos levar a terapia genética a todos os que dela precisam?
- As pessoas deveriam ter permissão para usar a terapia genética para melhorar as características humanas básicas?
- É correto usar a terapia no estágio pré-natal de desenvolvimento em bebês?
- Se as empresas farmacêuticas considerarem um tratamento de terapia genética muito pouco lucrativo, quem o desenvolverá?
