Powerpoint 3

Question 1

Requisitos de vetor ideal para transportar a ferramenta de modulação de DNA (por exemplo, shRNA, cDNA, CRISPR)

Answer 1

• Espaço suficiente para transportar grandes genes terapêuticos
• Alta eficiência de transdução / transfecção
• Capacidade de fornecer expressão estável e de longo prazo
• Inserir-se apenas nas células alvo específicas
• Evitar a inserção aleatória do gene terapêutico no genoma do hospedeiro
• Infetar células mitóticas, bem como células pós-mitóticas
• Capacidade de ser fabricado em grande escala
• Deve superar as barreiras extracelulares e intracelulares

Question 2

Resumidamente, o vetor tem que ser:
- 
-
-
-

Answer 2

• Funcional
• Duradouro
• Específico
• Seguro

Question 3

-

Answer 3

• patogénico / imunogénico

- causar inflamação

Question 4

Vantagens dos vetores virais:

Answer 4

• Pode ter como alvo tipos específicos de células
• Muito bom em alvejar e entrar nas células (alta eficiência de ‘entrada’)
• Podem ser modificados para que não se possam replicar e destruir células (partículas virais)

Question 5

Desvantagens dos vetores virais:

Answer 5

• Alguns podem causar respostas imunológicas em pacientes
• Eles podem carregar uma quantidade limitada de material genético
• Maior custo de produção

Question 6

O que são VLPs (viral-like particles)?

Answer 6

Vírus modificados, para não causarem doenças quando usados em pessoas

Question 7

Mecanismo de ação dos retrovirus?

Answer 7

o RNA vira é convertido em DNA pelo trnascriptase reversa e depois é eficientemente integrado no genoma do hospedeiro

Question 8

Para que são usados os retrovírus?

Answer 8

Introduzir genes novos ou alterados no genoma de células humanos e animai

Question 9

Vetores retrovirais são usados amplamente para estudar:

Answer 9

Oncogenes e outros genes humanos

Question 10

Lentivirus derivados do virus ____ tornaram-se as principais ferramentas para a entrega de genes em células de mamíferos

Answer 10

HIV-1

Question 11

Qual e a característica vantajosa dos lentivirus?

Answer 11

Capacidade de mediar a transdução potente e a expressão estável em células em divisão e não divisão, tanto in vitro quanto in vivo.

Question 12

Vantagens lentivírus:

Answer 12

• infetam tanto células em divisão como em não divisão
• Tropismo ampliado (tipo de células que podem infetar) pelo envelope VSV-G
• Expressão estável (podem integrar no genoma)
• não geram proteínas imunogénicas
• conseguem entregar fragmentos com até 9kb

Question 13

Que 3 genes precisam de ser expressos nos lentivirus para permitir a produção de partículas lentivirais que carregam o gene?

Answer 13

• Gag: poliproteína
• Pol: transcriptase reversa
• Env: proteína do envelope

Question 14

Em que células são normalmente produzidos os vetores/partículas lentivirais?

Answer 14

HEK 293T

Question 15

1. O “transfer plasmid” codifica:
2. O “packaging plasmid” codifica:
3. O “envelope plasmid” codifica:

Answer 15

1. transgene + contém 3’ e 5’ LTRs essenciais à promoção da transcrição de um mRNA viral pela RNAPII + sequência psi que sinaliza o empacotamento do genoma
2. genes necessários para a entrega e integração do genoma viral
3. genes para proteínas de envelope

Question 16

1. O “transfer plasmid” codifica:
2. O “packaging plasmid” codifica:
3. O “envelope plasmid” codifica:

Answer 16

1. transgene + contém 3’ e 5’ LTRs essenciais à promoção da transcrição de um mRNA viral pela RNAPII + sequência psi que sinaliza o “genoma packaging”
2. genes necessários para a entrega e integração do genoma viral
3. genes para proteínas do envelope

Question 17

Vantagens dos adenovírus:

Answer 17

• Os vetores adenovirais têm alta eficiência de tradução;
• Capacidade de inserções de DNA de até 8 kb;
• Títulos (concentração) extremamente altos e infetam células em divisão e diferenciadas;
• Não se integram no genoma das células hospedeiras e não têm efeitos mutagênicos relacionados à inserção aleatória no genoma.
• Baixa imunogenicidade

Question 18

Desvantagens dos adenovírus:

Answer 18

• Expressão transitória, uma vez que não estão integrados no genoma;
• Algumas proteínas virais ainda são expressas a partir do vetor adenoviral após a infeção do hospedeiro;
• Embora sua baixa imunogenicidade, os adenovírus são patógenos humanos comuns, e a infeção / transdução in vivo pode ser dificultada pela resposta imune do hospedeiro (problema potencial para terapia genética)

Question 19

Vantagens de vetores não virias:

Answer 19

• Melhor perfil de segurança / menos imunogênico

- Menor custo de produção

Question 20

Desvantagens de vetores não virias:

Answer 20

• Baixa eficiência de transfeção
• Captação celular difícil
• Fraca entrega direcionada

Question 21

Desafios da terapia genética:

Answer 21

● Identificar e conhecer as células que necessitam de tratamento, o gene alvo, bem como os possíveis efeitos da modificação genética no seu metabolismo;
● Encontrar uma maneira de entregar os genes de maneira eficaz para o tipo específico de células e, se necessário, ativá-los de forma que permaneçam “ligados”
○ Problema: a incapacidade do DNA de passar pela membrana celular devido ao seu grande tamanho e carga negativa
○ O DNA terapêutico precisa escapar das endonucleases celulares e da depuração renal
● Garantir que os novos genes sejam precisamente controlados pelo corpo
● Vetores mediando alta eficiência de transfecção “in vitro” muitas vezes falham em alcançar resultados semelhantes “in vivo”

Question 22

Vantagens da terapia genética:

Answer 22

• Potencial para eliminar e prevenir doenças hereditárias (fibrose cística, ADASCID, etc.).
• Possível cura para doenças do coração, AIDS e cancro.
• Pode ser usado para erradicar doenças das gerações futuras

Question 23

Desvantagens da terapia genética:

Answer 23

• A terapia de longa duração pode não ser alcançada por terapia genética (em células que se dividem rapidamente)
• A resposta imune ao gene transferido estimula um risco potencial para a terapia genética.
• Distúrbios causados por defeitos em vários genes não podem ser tratados de forma eficaz com terapia genética

Question 24

Problemas éticos da terapia genética:

Answer 24

• Quem terá acesso à terapia?
• Como podemos levar a terapia genética a todos os que dela precisam?
• As pessoas deveriam ter permissão para usar a terapia genética para melhorar as características humanas básicas?
• É correto usar a terapia no estágio pré-natal de desenvolvimento em bebês?
• Se as empresas farmacêuticas considerarem um tratamento de terapia genética muito pouco lucrativo, quem o desenvolverá?