PCR e Sequenciamento Flashcards
Qual o objetivo do método PCR?
Amplificar a amostra de DNA
Quais são os elementos necessários para fazer a PCR?
- Amostra de DNA
- Oligonucleotídeo iniciador
- DNA polimerase
- Desoxiribonucleotídeos tri-fosfatos
Quais são as etapas?
A PCR acontece dentro de termocicladores, equipamentos que variam a temperatura de forma cíclica. Ora aumenta, para promover a desnaturação da cadeia de DNA e permitir o início de uma nova replicação, ora diminui para permitir a formação da dupla-hélice e concluir aquela replicação.
No que se baseiam as técnicas de sequenciamento?
Elas têm o objetivo de determinar a sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA
O que ocorre em um método de sequenciamento?
No método de sequenciamento, a partir da molécula de DNA que se quer determinar a sequência, são replicadas outras moléculas. A forma como isso faz com que seja determinada a ordem dos nucleotídeos é a presença de didesoxiribonucleotídeos radioativamente marcados e desoxirribonucleotídeos para serem adicionados. Quando os didesoxiribonucleotideos são adicionados às fitas de DNA, a síntese é parada, já que eles não apresentam a hidroxila no carbono 3’ que permite a ligação do próximo nucleotídeo. O resultado disso é a formação de várias pequenas fitas finalizadas com um didesoxiribonucleotídeo marcado. Isso faz com que todas as posições sejam representadas por esses didesoxiribonucleotídeos marcados no final de cada uma dessas fitas, o que permite o sequenciamento de toda a cadeia de DNA.
Explique o funcionamento básico dos métodos de sequenciamento mais modernos.
As moléculas de DNA são fragmentada de forma aleatória, têm oligonucleotídeos de sequência conhecida na extremidade deles, e ficam, imobilizadas, cada uma, em uma substância sólida. Cada um desses fragmentos, pela atuação da DNA polimerase irá passar pelo processo de PCR e terá a amostra amplificada, formando os clusters. Cada um desses clusters será sequenciado simultaneamente, que é o que confere a grande eficiência do processo, o sequenciamento de vários clusters de forma simultânea. A identificação das bases que estão sendo adicionadas em cada um dos clusters pode ser feita por meio de vários métodos diferentes. Um exemplo é o pirossequenciamento, em que quando os desoxirribonucleotídeos tri fosfatados são adicionados, há a liberação de pirofosfato, o qual é o usado por uma enzima para produzir ATP. Esse ATP é utilizado pela enzima luciferase, que catalisa uma reação com luciferina e libera um pequeno flash de luz. Ou seja, quando um nucleotídeo é adicionado, um flash de luz é liberado.
