PCR e Eletroforese Flashcards
Como a dupla hélice do DNA é ligada?
Ligações de hidrogênio.
O que são ligações de hidrogênio?
São ligações não covalentes relativamente fracas que podem ser facilmente quebradas.
Qual a forma mais simples de promover a separação das fitas da dupla hélice de DNA?
Aquelecer a molécula de DNA até cerca de 90°C.
O que acontece se a temperatura for baixada lentamente?
As fitas complementares se unem novamente através das ligações de hidrogênio.
Qual o sentido de leitura de cada fita da dupla hélice?
5’ para 3’
O que significa a sigla PCR na biologia molecular?
Reação em cadeia da polimerase.
Qual a definição da PCR?
Sistema para replicação do DNA in vitro.
E o que se consegue utilizando a técnica de PCR?
Permite que uma “sequência alvo” de DNA seja amplificada em milhares de cópias em alenas algumas horas.
Qual a definição de “sequência alvo”?
Um gene específico.
PCR é uma sigla que pode ter outra definição nos exames laboratoriais. Qual é e para que é usado?
PCR - Proteína C reativa.
Usadi para investigar processos inflamatórios.
Qual nome do equipamento utilizado para realização da PCR?
Termociclador.
Como se dá o funcionamento do termociclador?
Oscila a temperatura em ciclos definidos para que amplificação do DNA aconteça.
Qual componente é colocado na máquina para análise?
Amostra de DNA in vitro (extraída do tecido e purificada).
Quem foi o pioneiro da PCR?
Kary Mullis - Bioquímico americano.
(1944-2019)
Qual foi o primeiro passo que Kary Mullis deu para desenvolvimento da técnica de RCP?
1983 》teve a ideia de utilizar um par de primers para amplificação de sequências alvo do DNA.
Em 1986, Kary Mullis deu seguimento ao desenvolvimento da técnica de PCR. Qual foi?
Utilização da enzima polimerase de Thermus aquaricus (Taq polimerase)
DNA polimerase: polimeriza a nova fita de DNA in vivi
taq DNA polimerase: polimeriza a nova fita de DNA in vitro (PCR)
O que é a Thermus aquaticus?
Espécie de bactéria que tolera elevadas temperaturas (termofílicas), encontrada em fontes hidrotermais.
Qual a temperatura ótima da Taq DNA polimerase e até qual é estável?
Temperatura ótima 72°C e estável até temperaturas superiores a 94°C.
Quais são os elementos necessários para realização da PCR? (5)
Extração da amostra de DNA;
Acrescentar primers ou iniciadores;
Inserir dNTPs: desoxirriboNucleotídeos TriFosfatados (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);
Acrescenta Taq. DNA polimerase;
Por fim, acréscimo de H2O, Tampão (para controle do PH) e MgCl2 (cofator para a Taq DNA polimerase).
O que são primers ou iniciadores?
Sequência curta de nucleotídeos que fornece uma extremidade 5’ a partir da qual a síntese pode iniciar.
Quais os estágios do termociclador?
Desnaturing - Desnaturação;
Annealing - Anelamento;
Extending - Extensão.
A qual temperatura acontece o estágio de desnaturação e para que serve?
94-95°C.
Quando há a separação da dupla fita de DNA.
Do estágio de anelamento do termociclador, qual a temperatura atingida e o que acontece?
50-56°C.
Há a inserção dos primers nos sítios específicos.
No terceiro estágio do termociclador qual temperarura é necessária e o que acontece?
72°C.
DNA polimerase acrescenta os dNTPs à fita, de acordo com o pareamento das bases.
Polimerização propriamente dita.
Taq Polimerase.
Qual procedimento é feito após a reação da PCR? (3)
Amostras são purificadas;
Aplicadas em gel de Agarose ou Poliacrilamida;
Submetidas à eletroforese de ácidos nucleicos.
O que é a eletroforese em gel de Agarose?
Técnica utilizada que promove a movimentação de moléculas submetidas a um campo elétrico.
O que acontece na eletroforese em gel de Agarose?
São separadas de acordo com seu peso molecular, sendo que as menores correm mais rápido e as maiors correm mais lentamente.
Para qual dos polos as partículas de DNA e RNA vão e por quê?
Para o polo positivo (ânodo) pois os nucleotídeos são carregados negativamente decido a presença dos fosfatos.
O que é a Agarose usada em gel na eletroforese?
Um gel derivado do agar-agar (planta).
E o que esse gel de Agarose permite que aconteça na técnica da eletroforese?
Ele forma uma malha porosa, que permite a passagem de moléculas atravesra diferença de voltagem.
E como é feita a classificação dos elementos na eletroforese em gel de Agarose?
Separa fragmentos de tamanhos diferentes.
Qual o passo a passo para realizar a eletroforese em gel de Agarose? (4)
Preparo do gel;
Aplicação da amostra de DNA no gel (DNA + Corante + intercalante + glicose);
Posicionar o gel na cuba e cobrir com TBE;
Ligar a cuba à fonte de energia para aplicação do potencial.
O que é o transiluminador?
Bandas de DNA fluorescentes que utilizam luz UV e corantes.
Agentes intercalantes que fluorescem na incidência de luz UV.
O que fica na parte superior na análise da eletroforese?
Os poços.
Um poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de referência que contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos
Como é feita a interpretação dos géis?
Da esquerda pra direita.
O que é o ladder?
Marcador de massa molecular.
Fragmentos de DNA de tamanhos e concentrações conhecidos comercializado pela indústria de biotecnologia.
E para que serve o ladder?
Inferir, por comparação, o tamanho dos fragmentos presentes na amostra analisada.
Qual pode ser uma aplicação da eletroforese?
Detecção de vírus da hepatite B por exemplo.
