PCR e Eletroforese

Question 1

Como a dupla hélice do DNA é ligada?

Answer 1

Ligações de hidrogênio.

Question 2

O que são ligações de hidrogênio?

Answer 2

São ligações não covalentes relativamente fracas que podem ser facilmente quebradas.

Question 3

Qual a forma mais simples de promover a separação das fitas da dupla hélice de DNA?

Answer 3

Aquelecer a molécula de DNA até cerca de 90°C.

Question 4

O que acontece se a temperatura for baixada lentamente?

Answer 4

As fitas complementares se unem novamente através das ligações de hidrogênio.

Question 5

Qual o sentido de leitura de cada fita da dupla hélice?

Answer 5

5’ para 3’

Question 6

O que significa a sigla PCR na biologia molecular?

Answer 6

Reação em cadeia da polimerase.

Question 7

Qual a definição da PCR?

Answer 7

Sistema para replicação do DNA in vitro.

Question 8

E o que se consegue utilizando a técnica de PCR?

Answer 8

Permite que uma “sequência alvo” de DNA seja amplificada em milhares de cópias em alenas algumas horas.

Question 9

Qual a definição de “sequência alvo”?

Answer 9

Um gene específico.

Question 10

PCR é uma sigla que pode ter outra definição nos exames laboratoriais. Qual é e para que é usado?

Answer 10

PCR - Proteína C reativa.
Usadi para investigar processos inflamatórios.

Question 11

Qual nome do equipamento utilizado para realização da PCR?

Answer 11

Termociclador.

Question 12

Como se dá o funcionamento do termociclador?

Answer 12

Oscila a temperatura em ciclos definidos para que amplificação do DNA aconteça.

Question 13

Qual componente é colocado na máquina para análise?

Answer 13

Amostra de DNA in vitro (extraída do tecido e purificada).

Question 14

Quem foi o pioneiro da PCR?

Answer 14

Kary Mullis - Bioquímico americano.
(1944-2019)

Question 15

Qual foi o primeiro passo que Kary Mullis deu para desenvolvimento da técnica de RCP?

Answer 15

1983 》teve a ideia de utilizar um par de primers para amplificação de sequências alvo do DNA.

Question 16

Em 1986, Kary Mullis deu seguimento ao desenvolvimento da técnica de PCR. Qual foi?

Answer 16

Utilização da enzima polimerase de Thermus aquaricus (Taq polimerase)
DNA polimerase: polimeriza a nova fita de DNA in vivi
taq DNA polimerase: polimeriza a nova fita de DNA in vitro (PCR)

Question 17

O que é a Thermus aquaticus?

Answer 17

Espécie de bactéria que tolera elevadas temperaturas (termofílicas), encontrada em fontes hidrotermais.

Question 18

Qual a temperatura ótima da Taq DNA polimerase e até qual é estável?

Answer 18

Temperatura ótima 72°C e estável até temperaturas superiores a 94°C.

Question 19

Quais são os elementos necessários para realização da PCR? (5)

Answer 19

Extração da amostra de DNA;
Acrescentar primers ou iniciadores;
Inserir dNTPs: desoxirriboNucleotídeos TriFosfatados (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);
Acrescenta Taq. DNA polimerase;
Por fim, acréscimo de H2O, Tampão (para controle do PH) e MgCl2 (cofator para a Taq DNA polimerase).

Question 20

O que são primers ou iniciadores?

Answer 20

Sequência curta de nucleotídeos que fornece uma extremidade 5’ a partir da qual a síntese pode iniciar.

Question 21

Quais os estágios do termociclador?

Answer 21

Desnaturing - Desnaturação;
Annealing - Anelamento;
Extending - Extensão.

Question 22

A qual temperatura acontece o estágio de desnaturação e para que serve?

Answer 22

94-95°C.

Quando há a separação da dupla fita de DNA.

Question 23

Do estágio de anelamento do termociclador, qual a temperatura atingida e o que acontece?

Answer 23

50-56°C.

Há a inserção dos primers nos sítios específicos.

Question 24

No terceiro estágio do termociclador qual temperarura é necessária e o que acontece?

Answer 24

72°C.

DNA polimerase acrescenta os dNTPs à fita, de acordo com o pareamento das bases.

Polimerização propriamente dita.

Taq Polimerase.

Question 25

Qual procedimento é feito após a reação da PCR? (3)

Answer 25

Amostras são purificadas;
Aplicadas em gel de Agarose ou Poliacrilamida;
Submetidas à eletroforese de ácidos nucleicos.

Question 26

O que é a eletroforese em gel de Agarose?

Answer 26

Técnica utilizada que promove a movimentação de moléculas submetidas a um campo elétrico.

Question 27

O que acontece na eletroforese em gel de Agarose?

Answer 27

São separadas de acordo com seu peso molecular, sendo que as menores correm mais rápido e as maiors correm mais lentamente.

Question 28

Para qual dos polos as partículas de DNA e RNA vão e por quê?

Answer 28

Para o polo positivo (ânodo) pois os nucleotídeos são carregados negativamente decido a presença dos fosfatos.

Question 29

O que é a Agarose usada em gel na eletroforese?

Answer 29

Um gel derivado do agar-agar (planta).

Question 30

E o que esse gel de Agarose permite que aconteça na técnica da eletroforese?

Answer 30

Ele forma uma malha porosa, que permite a passagem de moléculas atravesra diferença de voltagem.

Question 31

E como é feita a classificação dos elementos na eletroforese em gel de Agarose?

Answer 31

Separa fragmentos de tamanhos diferentes.

Question 32

Qual o passo a passo para realizar a eletroforese em gel de Agarose? (4)

Answer 32

Preparo do gel;
Aplicação da amostra de DNA no gel (DNA + Corante + intercalante + glicose);
Posicionar o gel na cuba e cobrir com TBE;
Ligar a cuba à fonte de energia para aplicação do potencial.

Question 33

O que é o transiluminador?

Answer 33

Bandas de DNA fluorescentes que utilizam luz UV e corantes.

Agentes intercalantes que fluorescem na incidência de luz UV.

Question 34

O que fica na parte superior na análise da eletroforese?

Answer 34

Os poços.

Um poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de referência que contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos

Question 35

Como é feita a interpretação dos géis?

Answer 35

Da esquerda pra direita.

Question 36

O que é o ladder?

Answer 36

Marcador de massa molecular.

Fragmentos de DNA de tamanhos e concentrações conhecidos comercializado pela indústria de biotecnologia.

Question 37

E para que serve o ladder?

Answer 37

Inferir, por comparação, o tamanho dos fragmentos presentes na amostra analisada.

Question 38

Qual pode ser uma aplicação da eletroforese?

Answer 38

Detecção de vírus da hepatite B por exemplo.