PCR Flashcards
Para una PCR se requiere (4)
- Secuencia de DNA
- Enzima DNA polimerasa.
- Desoxiribonucleotidos (dNTP)
- Primers
Enzima que polimeriza una cadena de DNA tomando como molde una preexistente.
DNA polimerasa
Equipos donde se realiza:
termocicladores
Amortiguador:
pH adecuado (8.4)
Los iniciadores de PCR tienen alto contenido en:
G-C
Para el inicio de la desnaturalización, se necesita una temperatura de:
95º C
Ciclos de amplificación (3)
o Temperatura de desnaturalización.
o Temperatura de alineamiento (4G + C) + (2A+T)
o Temperatura extensión
Esquema de la PCR (3)
Inicio de la desnaturalización
Ciclos de amplificación
Amplificación final
Durante la desnaturalización…
Se separan las cadenas de DNA (95ºC)
Durante la hibridación..
Los primers se alinean al extremo 3’
Significado de PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
Temperatura para la hibridación
50º C a 60º C
Durante la extensión…
La Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado de primers y agrega dNTPs complementarios para crear cadenas completas
Temperatura de la extensión
72ºC
Al final de la PCR se realiza:
Gel de electroforesis
Detección cualitativa de un segmento de ADN
PCR estándar
Detección cualitativa de varios segmentos de ADN en una sola reacción de PCR
PCR múltiple
Detección de polimorgismos genéticos (SNPs)
PCR-RFLP
Detección de virus ARN
RT (transcriptasa reversa) PCR
Detección cualitativa de uno o varios segmentos de ADN, cuantificación de ADN en la muestra o expresión de genes
PCR-TR (tiempo real) o qPCR
Técnica utilizada para separar el ADN, ARN o moléculas o proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica.
Electroforesis
Elementos necesarios para una electroforesis (4)
Cámara de electroforesis
Gel de agarosa
Marcador de peso molecular
Transiluminador violeta
Es el método más sensible para cuantificar los ácidos nucleicos.
PCR tiempo real (qPCR)
PCR estándar donde se utilizan tinciones o sondas con fluoróforos para la detección de los fragmentos amplificados
PCR tiempo real (qPCR)
Síntesis de cADN a partir de ARN mediante transcripción reversa, seguido de una PCR
RT-PCR (transcriptasa reversa)
PCR estándar con paso posterior de digestión con enzimas de restricción
PCR-RFLP
Amplificación de 2 o más segmentos de ADN utilizando varios partidores en una sola reacción de amplificación. La detección de la amplificación es mediante geles de agarosa.
PCR múltiple
Amplificación de un segmento de ADN utilizando dos partidores. La detección de la amplificación es mediante geles de agarosa
PCR estándar
Sistemas reporteros de fluoresencia de la PCR en tiempo real (qPCR)
Específicos
No específicos
Sondas fluorescentes de oligonucleótidos con un reportero fluorescente.
Específico
Moléculas intercalantes que tienen afinidad por el dsDNA y generan una señal fluorescente.
No específicos
Dos tipos de cuantificación de la PCR en tiempo real (qPCR)
Absoluta y relativa
Evaluar los cambios en la expresión de genes en distintos estados fisiológicos.
Cuantificación relativa
- Conocer el número exacto de copias amplificadas del blanco.
- Concentración precisa de ácidos nucleicos en una muestra.
- Medir la carga viral o la carga bacteriana de un tejido.
Cuantificación absoluta
Los cambios en la expresión de genes en distintos estados fisiológicos para la cuantificación relativa se basan en:
Los niveles de RNAm del gen blanco comparados con un gen de referencia que no cambia su expresión a pesar de que los estados fisiológicos se modifiquen por diversas causas.
