ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ PCR ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΦΥΤΩΝ

Question 1

Πως γίνεται ο σχεδιασμός των εκκινητών ?

Answer 1

• Εξετάζουμε την αλληλουχία του dna στόχου
• Εντοπίζουμε το κομμάτι του γενωμικού υλικού που θέλουμε να αναπαράγουμε και το εξετάζουμε ώστε να είναι μοναδικό στο γένωμα του οργανισμού

Question 2

Ποια τα κριτήρια επιλογής εκκινητών ?

Answer 2

• Οι εκκινητές μπορεί να είναι από 15-30bp ενώ το περιεχόμενο CG μπορεί να είναι 40-60%
• Στο 3’ άκρο του εκκινητή καλό είναι να υπάρχουν 2 CG όχι όμως περισσότερα καθώς δημιουργούν πρόβλημα σε μη εξειδικευμένο υβριδισμό
• Η διαφορά του Tm μεταξύ των 2 εκκινητών δεν πρέπει να υπερβαίνει τους 5 βαθμούς
• Για μη εξειδικευμένους εκκινητές καλό είναι το 3΄άκρο να είναι συντηρημένο ( 3bp τουλάχιστον )

Question 3

Πως υπολογίζουμε το Tm ?

Answer 3

Αν ο εκκινητής είναι μικρότερος απ 25 βάσεις το υπολογίζουμε : Tm =4( G+C ) + 2( A+T), ενώ αν είναι μεγαλύτερος απ 25 υπολογίζεται μέσω μηχανές υπολογισμού

Question 4

Τι λέει ο νόμος του gibbs ?

Answer 4

Όσo μικρότερη είναι η τιμή τόση περισσότερη ενέργεια απαιτείται για να «σπάσει» μία δευτερογενής δομή.
Δε δεχόμαστε εκκινητές με τιμές ΔG< -7 KCal/mol
Η δημιουργία φουρκέτας μειώνει σημαντικά την απόδοση της αντίδρασης