PCR Flashcards
Que es la PCR?
Es la reacción en cadena polimerasa
Es un método donde vamos a generar muchas copias de ADN de una región que nos interese ampliando el segmento de ADN y poderlo observar fácilmente
Que se necesita para llevar a cabo la PCR?
ADN Fragmento particular (DNA molde)
ADN polimerasa enzima
dntps bloques de construcción o desoxirribonucleotidos trifosfatados
Mg+2
primer o Cebador
*buffer (mantener el pH)
Porque se necesitan dntps?
Porque la polimerasa o enzima requiere de nucleotidos. con 3 fosfatos . es la única forma en la que puede trabajar la polimerasa con los neuclotidos
Consisten en una mezcla con iguales cantidades de datp, dctp, dgtp y dttp. Se usan con una concentración final de 200mm
Porque se necesita Mg+2?
Es el cofactor de la enzima. solo funciona la enzima si hay magnesio
Es el cofactor de la taq polimerasa se une formando una salnagueno se puede utilizar sola MgCl2
Porque se necesita un cebador o primer?
El primer va pegar los nucleótidos de RNA creando una cadena y así la polimerasa pueda empezar a pegar nucleótidos
Dirección va en sentido 5’a3’ y 3’ a 5’ . 2 primers casa uno para cada cadena
También se utiliza para poder determinar el fragmento de ADN que quiere ampliar
se necesita del primer especifico para poder seleccionar parte del ADN que se va a copiar
Síntesis del ADN: primers específicos hibridan con la cadena que tiene que ser copiada
Que es la amplificación?
Multiplicación exponencial de números de copias de un fragmento determinado de DNA
Cuales son los Ciclos de amplificación?
Múltiples ciclos darán lugar a un incremento exponencial en el número de copias
Primer ciclo
Desnaturalizar: separan hebras a 95°c No pierden forma ni caract
Hibridación: primer se une al ADN 50°c a 60°c
Extensión de la cadena: 72°c a 75°c
Se realizan alrededor de 30 ciclos
Cual es el perfil de la reacción?
Primer fase del PCR, el rendimiento es limitado debido a la baja concentración del DNA molde. Se alcanza una fase lineal donde el incremento en el producto es aprox el doble por ciclo hasta que se llegue a un plateau
Características del DNA molde
Buena calidad- cuidar de su extracción-No esté fragmentado
Concentración elevada-obtener de varios ciclos varias copias para poder ver fácilmente el ADN
Secuencia-gran cantidad de guanina y citosina- entregas la unión será más fuerte
Características de la enzimas utilizada?
Se necesita una enzima termoestable. Se utiliza DNA pol termoestable
En organismos extremófilos -viven en condiciones extremas.
Para que se utiliza el buffer?
Es una solución que impide que se modifique el ph (es una solución amortiguadora ) mantiene el ph de 8.5
Favorece el mantener ph y que la polimerasa trabaje bien
Solución modificadora- reduce el backround- ver si se amplificó algo o no
DMSO evíta la interferencia al buscar nuestro amplificado
Características del primer
Tiene un cuidadoso diseño-ubicarse en la sección de ADN que nos interesa copiar
Longitud-18 a 25 bases de extensión. Se necesitan 2 primers: REVERSE y otro FORWARD
Evitar secuencias repetidas-se pueden producir horquillas o diaremos
Valores de temperatura: 2°c entre uno de otro• temperatura en la que se alinea uno y se alinea otro. El extremo 3’ debe terminar en C o G
Homología de secuencia: nucleotidos de RNA se una de manera específica a la cadena de ADN de la secuencia que queremos amplificar
Como se puede visualizar los resultados de la PCR?
A través de una electroforésis
El producto del PCR se revuelve generalmente en un gel de agarosa. Se utiliza geles de poliacrilamida cuando se requiere mayor resolución
Que es la electroforesis?
Es una técnica de laboratorio que se usa para separar moléculas de ADN, ARN o proteínas en función de su tamaño y carga eléctrica. Se usa corriente eléctrica para mover estas molecular a través de un gel
Existen en papel filtro y acetato de celulosa, gel de agarosa, capilar etc
Cuales son los controles experimentales?
CONTROL POSITIVO: muestra conocida- que tenga el fragmento a amplificar
CONTROL NEGATIVO: agua en lugar de ADN, controlar contaminación
Cual es la programación de los ciclos ?
De 28 a 30 ciclos
Desnaturalización inicial 95ºc (3 a 5min)
Desnaturalización 95ºC (15 a 60 seg)
Alineamiento (20-60seg)
extensión (desde 30 seg) de acuerdo a la temperatura optima de la dna polimerasa utilizda (72°c taq)
Extensión final 72°c
Hold 4 °c
Cuáles son los tipos de PCR?
MULTIPLEX PCR
NESTED PCR
PCR IN SITU
RT-PCR
PCR en tiempo real
En que consiste el multiplex PCR?
Ampliación de múltiples pares de primers donde los resultados serán múltiples bandas. uso en diagnóstico médico
En que consiste el NESTES PCR?
reducir productos indeseados
Se realiza una segunda ronda de PCR utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco mas internamente que los primeros
En que consiste el PCR in situ?
PCR realizada sobre preparaciones como tejidos o células fijas en un portaobjeto. Primero amplificación al DNA blanco y luego dirección mediante hibridación in situ convencional
EN que consiste el RT-PCR
amplificación de un fragmento cuyo material de partida es CDNA, el cual fue generado por transcripción reversa a partir de una muestra de RNA
(de arn a CADN)
En que consiste el PCR en tiempo real?
como sucede un ciclo podemos ir viendo el ADN si se va amplificando. Nos va gratificando la máquina lo que necesitamos. Se realiza de manera simultánea. Da una señal y lo grafica, no se necesita electroforesis. Flourescencia para detectar la cantidad de DNA producido
Cuales son los tipos de ADN?
nuclear, mitocondrial, plasmídico, cloroplástico en plantas, viral
clasificación del ADN?
ADN nuclear
ADN mitocondrial
Cuáles son las fuentes de ADN?
sangre, tejidos, fluidos celulares, saliva, células en cultivo, pelo, uñas, huesos, dientes
Cuál es el objetivo de una buena extracción de ADN?
cantidad
calidad ( no fragmentado)
pureza (ausencia de contaminación a.a, proteínas, carbohidratos)
Qué técnicas de biología celular utilizan ADN?
southern biot
PCR
Secuenciación
Cuáles son los métodos de extracción de ADN genómico?
Pre-tratamiento
Lisis celular
Purificación de ADN
En que consiste el pretratamiento?
Neutralización
tratamiento con solventes orgánicos
En que consiste la lisis celular?
Disrupción mecánica (vibraciones) (Métodos físicos )
agentes químicos (detergentes)
en que consiste la purificación de ADN?
agregado de sales LiCl, NaCl
extracción orgánica- separación de fases
Visualización y cuantificación de los resultados
FLourómetro y espectrometría
ADN carga - y carga al polo +
