PCR Flashcards
Una PCR requiere (4)
- Secuencia de ADN
- Enzima DNA polimerasa
- Desoxirribonucleótidos (nNTP)
- Primers o iniciadores
La PCR se realiza en un _______.
Termociclador
La DNA polimerasa queríamos proviene de un geisegrg y y se llama ______.
Thermus acuáticus
La temperatura de soporte de la DNA polimerasa es de _____ grados.
95
Es un cofactor de la taw polimerasa.
Cloruro de magnesio
Se encarga de mantener el Ph
Amortiguador o buffer
Los iniciadores los diseñamos haciéndolos complementarios a la secuencia de DNA que estoy buscando, vamos a tener 2 tipos de amortiguadores que son …
- Forward: Va de 5’ a 3’
- Reverse: Va de 3’ a 5’
Amortiguador que va de 5’ a 3’
Forward
Amortiguador que va de 3’ a 5’
Reverse
Los primers o amortiguadores tienen muchas (2) para que sean más estables y complementarios al DNA.
Citosinas y Guaninas
Fases de la PCR (3)
- Desnaturalización
- Hibridación
- Temperatura de extensión
Describa la fase de desnaturalización.
Hay que separar la hélice de ADN y como no hay elicasa usamos una temperatura de 95 grados.
Describa la fase de hibridación:
Hacer que los primeros encuentren su complemento bajando la temperatura a temperatura de alineamiento. Tm
Describa la fase de temperatura de extensión.
Ponemos la temperatura de extensión (72 grados) para que la polimerasa empiece a poner nucleótidos.
Se deben realizar ___ - ____ ciclos de PCR.
30-40
PCR que dice si existe o no el gen que estoy buscando pero no dice cuántos de estos hay.
PCR punto final
PCR que permite ver varios genes en una sola toma de muestra.
PCR múltiple
PCR que usamos para buscar RNA.
PCR transcriptas reversa
Para Covid usamos esta mezcla de PCR’s
- Transcriptasa reversa y tiempo real
PCR que nos sirve para conocer la CARGA VIRAL.
- PCR tiempo real.
Para poder cuantificar la carga viral en PCR tiempo real le ponemos ______.
Colorantes
Tipos de colorantes que usamos en PCR tiempo real.
- Específicos
- No específicos
Colorante que se une a una DOBLE cadena de DNA
NO específicos
Se dice que los colorantes no específicos son no específicos porque ….
Los primers son un T-loop y como un t-loop tiene doble cadena se pueden unir a los primers y marcarlo como si fueran el segmento que buscamos.
Colorantes que se unen a una sola cadena de DNA.
Específicos
Los colorantes son específicos porque…
Son complementarios a la cadena de DNA que estamos buscando.
Después de hacer la PCR hacemos una _____.
Electroforesis
Si queremos buscar la presencia de DNA de bacterias en una PCR buscaremos el gen.
16s
Para hacer una electroforesis se necesita (3)
- Cámara de electroforesis
- Gel de agarosa
- Marcador de peso molecular
Electroforesis:
Es la mezcla de moléculas de ADN o proteínas de tamaño conocido que permite determinar por comparación el tamaño de las moléculas sometidas a electroforesis.
Marcador de peso molecular.
Tipos de cuantificación: (2). y sus características.
- Absolura: Mide y cuantifica los genes (Ejemplo: Carga viral).
- Relativa: Evalúa los cambios en la expresión de un gen en una mezcla de ácidos nucleicos
