P2 Flashcards
O que é plasmídeo? Qual é a importância dele na recombinação de RNA?
Local da bactéria onde ocorre a recombinação. É escolhido este local por apresentar DNA, diferente do Cromossomo central (DNA circular), está em grande quantidade dentro da célula.
Qual é a principal e primeira proteína produzida com recombinação genética? Por que foi importante a obtenção dessa proteína?
Insulina. Foi importante pois para a extração dessa proteína, anteriormente envolvia o sacrifício de animais, especialmente suínos.
Explique como a PCR simula o funcionamento normal da célula no quesito duplicação do DNA.
A duplicação dentro das células ocorrem da seguinte maneira:
Como a molécula de DNA se abre, necessita da DNA polimerase criando um filamento 5’ p/ 3’ continuamente no filamento de direção 3’ 5’ e descontinuamente de 5’ 3’ (formando fragmentos de Okazaki). Mas para iniciar necessita de primer (sequência de RNA de 10 a 15 nucleotídeos - esse é formado por RNA polimerase). Ela é semi-conservativa pois conserva um filamento mãe em cada DNA formado.
Da mesma forma o PCR irá criar o finalmento por meio da utilização inicialmente de um primer e em seguida a DNA polimerase. No entanto a enzima DNA polimerase utilizada é a DNA Taq polimerase retirada da bactéria Thermus aquaticos pois estes são encontrados em lava vulcânica e aquentam altas temperaturas.
Em relação ao cDNA: Qual a tecnologia para sua obtenção e qual sua aplicação?
Objetivo: tecnologia recombinante teve objetivo inicial para fazer clonagem de genes de interesse. O problema foi tentar fazer a bactéria transcrever e traduzir para formar a proteína, pois a utilização do gene eucarioto acabou falhando porque necessita de splicing para formar a proteína correta, mas o procarioto não faz splicing. Foi necessário a utilização do mRNA que foi transcrito por meio da transcriptase reversa (vírus) formando um único filamento de DNA que depois tem o outro filamento formado por DNA polimerase, formando cDNA (DNA complementar). Este pode ser inserido na bactéria para realizar a técnica de DNA recombinante.
Diferencie clonagem de DNA em bactéria de clonagem em PCR.
PCR pode clonar quantidades grandes de DNA, até cromossomos inteiros, em bactéria pode não comportar e perder o material genético. Precisa ser material pequeno para bactéria. DNA tem custo mais baixo porque a célula contém o material necessário para realização da transcrição/tradução, basta manter a bactéria viva, enquanto para o PCR necessita comprar.
Quais são as aplicações práticas para a clonagem em bactérias?
Conseguir amplificar DNA (duplicar/clonar). Desvantagem (uso no máximo 5 genes). Se deseja utilizar somente a duplicação pode utilizar gene normal, se quiser formar proteínas, utilizar cDNA. Vantagem é reprodução/multiplicação acelerada.
Quais as aplicações práticas para aplicação clonagem em termociclador.
Amplificação/clonagem de DNA/gene/cromossomo. No termociclador da pra fazer material genético em grande quantidade. Termociclador não é utilizado para formar proteína, somente gene/cromossomo. A Taq polimerase é uma DNA utlizada de uma batéria isolada de lava de vulcão por suportar altas temperaturas.
No que constitui as vacinas de RNA?
(CORRIGIR)
Vacina mais utilizada. Precisa ser refrigerada para não degradar o RNA. Maior eficiência, traduzido só ao entrar.
Vacina covid: mRNA traduzido, forma proteína da capsula,
No que constitui vacinas de DNA?
(COMPLEMENTAR)
Não precisa refrigerar, DNA demora para degradar, necessita de estabilizante, custo
Por que vacinas de RNA são consideradas mais seguras que vacinas de DNA?
Porque RNA entra no citoplasma, tem que ser transcrito e traduzido, enquanto o DNA entra direto no nucleo, estando exposto ao nosso DNA.
Explique o motivo da utilzação da transcriptase reversa para a recombinação genética:
A primeira tentativa da multiplicação de insulina não obteve êxito pois pegaram um gene, este deveria passar por splicing, mas não passou pois a célula procariota não faz splicing, logo a proteína formada não era a insulina. Para corrigir o problema, isolaram o RNA mensageiro ao invés do gene, pois já passou por splicing. Assim, o RNA é transformado em DNA pela transcriptase reversa que gera um filamento de DNA e em sequência é formado um filamento complementar por uma DNA polimerase formando o cDNA (DNA complementar) que ao passar por transcrição e tradução formou com êxito a proteína desejada.
O que é o cDNA?
Duplo filamento de DNA formado por mRNA transcrito por transcriptase reversa.
Como é adicionado o cDNA no plasmídeo?
É utilizado a enzima de restrição para quebrar a ligação fosfodiester do cDNA e do DNA do plasmídeo, ligando ambos um ao outro.
O que é PCR?
Equipamento responsável por duplicar/produzir em grande quantidade de material genético (DNA). É feito a extração do DNA puro das células e duplicação para aumentar a quantidade.
O que é a sigla PCR?
Polymerase Chain Reaction
Qual é a função da vacina
Fazer com que o corpo reconheça os antígenos (vírus) fazendo o corpo produzir anticorpo contra o antígeno.
Vacina convencional
Utiliza virus atenuado (reduz a capacidade de um virus em inserir o material genético na célula). Célula dentrítica reconhece e inicia a ativação de genes para produzir anticorpos.
Defina infecção viral
Vírus liberar material genético na célula
Processos de atenuação
(COMPLEMENTAR)
- Deixa vírus à baixas temperaturas para desacelerar o seu processo de infecção
- Fazer ele tentar injetar material genético diversas vezes até perder sua capacidade de injetar material genético (atenuar)
Clonagem
Utilizado para fazer milhares de cópias de um gene ou fragmento de DNA.
Plasmídeos
São moléculas extracromossômicas circulares de DNA bacteriano, estão em grande quantidade e tem duplicação independente.
Disserte sobre a estrutura de um vírus e sobre o ciclo lisogênico e lítico feito por eles na célula hospedeira.
Vírus é uma partícula proteíca que carrega material genético (não é célula!). No vírus o material genético pode ser tanto RNA (retrovírus) ou DNA (adenovírus).
- Como ele ta estruturado
- Não tem núcleo
- Transcriptase reversa enzima
- Nem todos tem capsídeo
- Proteínas do envelope
- Finalidade: formar outros vírus, jogando material genético em célula hospedeira
Ciclo lisogênico (adenovírus): vai ser acoplado ao DNA da célula. Se for eucarioto vai para núcleo, procarioto, citoplasma. Se for retrovírus, RNA precisa ser transformado em DNA por meio da transcriptase reversa.
Ciclo lítico(adenovírus ou retrovírus): forma novas células imediatamente, mata célula hospedeira, células hospedeiras são específicas pra cada vírus. Coloca material genético (RNA ou DNA) que passa a ser duplicado, transcritos e traduzidos para formação de capsídeos, cápsulas. Se for retrovírus, RNA precisa ser transformado em DNA com transcriptase reversa que estava presente no vírus).
Diferencie vírus de bactérias quanto a estrutura.
Bactérias são células procarióticas que são envoltas por membrana celular, carregam material genético. Vírus são partículas que carregam material genético, são seres não vivos. O vírus apresenta seu material genético envolto por um um capsídeo formado por proteínas e em alguns casos os vírus possuem um envelope ao seu redor. As proteínas presentes no envelope possuem a função de reconhecer a membrana que irá infectar. Caso o material genético seja um DNA, este é chamado de adenovírus, se RNA, retrovírus. Bactérias, diferente dos vírus, apresentam membrana plasmática, DNA e RNA(ambos, não um ou o outro), geração de ATP, ribossomos, atividade metabólica, citoplasma e faz divisão celular.
Transcriptase reversa
Enzima presente em um retrovírus, é liberado na infecção de uma célula eucarionte, a procarionte oferece o filamento de RNA que é lido pela trans. reversa, forma um filamento de DNA.
Diferencie Adenovírus e retrovírus
Adenovírus = DNA
Retrovírus = RNA
Enzima de restrição
Corta as duas fitas do DNA humano e da bactéria no mesmo sítio, rompendo a ligação fosfodiester. O DNA pode se ligar ao outro com pontas adesivas formando o DNA recombinante.
Etapas do PCR
- Desnaturação: Aquecer a 96ºC para romper a ligação de hidrogênio, abrindo o duplo filamento em dois filamentos separados
- Anelamento: Reduz a temperatura a 50-56ºC e adiciona-se 1 primer por filamento, estes irão se unir à sequência complementar.
- Extensão: Aumento da temperatura a 72ºC, DNA (Taq) polimerase irá construir filamentos complementares até o final
Essas etapas se repetem por inúmeros ciclos, conseguindo clonar exponencialmente o fragmento de DNA desejado.
Quais são os processos de produção de uma vacina?
- Em laboratório (in vitro), o agente causador da doença é identificado e as estratégias para combatê-lo são estudadas
- O objetivo é identificar o antígeno (substância que desencadeia a resposta imunológica)
- Fase pré-clínica: a eficácia e segurança da vacina são testadas em células (in vitro) e animais (in vivo).
- Fase clínica: a eficácia e segurança da vacina são testadas aleatoriamente em seres humanos (in vivo) em grupos pequenos e posteriormente, em centenas e milhares de pessoas
- Fabricação: a vacina precisa ser fabricada, autorizada pelos órgãos competentes e alocada no mercado.
Criação da vacina de RNA
- Cientistas identificam a parte do código genético viral (RNA) que contém instruções para a fabricação da proteína spike.
- Em laboratório, eles criam uma sequência de RNA mensageiro com esse código. A troca de uma molécula, a uridina, diminui as chances de que o corpo identifique o RNA sintético como uma ameaça.
- O mRNA é envolvido em uma capa de nanopartículas lipídicas para protegê-lo e facilitar sua absorção pelas células. Está pronto para ser injetado em humanos.
Interação da vacina RNA na célula humana
- O RNA parcialmente estabilizado é encapsulado numa microesfera de lipídio e é inserido no músculo através da seringa
- A microesfera de lipídio entra na célula e o RNA é despejado pelo ribossomo dentro do citoplasma e não atinge o núcleo, ele fica no citoplasma
- A célula reconhece o RNA mensageiro em seu citoplasma e rapidamente esse RNA é identificado pelos ribossomos
- Uma proteína é sintetizada
- Depois o RNA é degradado (já não é funcional) e nunca irá chegar no núcleo
Vacina de DNA
Baseia-se no uso de sequências do material genético do agente infeccioso. Estas sequências são inseridas em vetores (plasmídeos ou vetores virais). A estrutura da vacina de DNA inclui a clonagem genes ou fragmentos de genes relacionados à virulência ou patogenicidade de um microrganismo.
Em relação à vacina de RNA, a vacina de DNA tem _________ (maior/menor) custo em larga escala, refrigeração ____________________ (é/não é) necessária.
Menor, não é.
Etapas da vacina de DNA
- isolar um fragmento ou gene do material genético do microrganismo, justamente aquele que é responsável pela produção da proteína capaz de despertar o sistema imune;
- injetar esse gene em um hospedeiro que passará a sintetizar a mesma proteína que causa a infecção do vírus.
Quais são as limitações da vacina de DNA?
Garantia de que o fragmento de interesse será inserido no material genético humano;
Garantia de que será inserido em sequência não codificadora;
Garantia de muitas células foram contempladas com a sequência de interesse.
Os anticorpos são _____________ _____________________ chamadas de ____.
Proteínas imunoglobulinas; IG.
Clonagem terapeutica
Ambas iniciam igualmente (terapeutica e reprodutiva): uma célula somática 2n é inserido em um óvulo que teve seu núcleo retirado. A célula fecundada pode ser inserida em uma terceira espécie. A célula na tuba uterina vai se multiplicando, formando células tronco (totipotentes), em sequência a mórula (16 células) que começam a se aglomerar formando o blastocisto ou embrioblasto (pluripotente). Daqui podem ser utilizado o material em qualquer uma das etapas: célula-tronco, mórula ou blastocisto, dependendo do seu objetivo.
Diferencie clonagem terapêutica de clonagem reprodutiva
Ambas tem seus inícios semelhantes mas a clonagem terapêutica tem o objetivo de obter principalmente células-tronco para formar algum tipo de tecido em específico, usar em tratamento de doenças, etc., enquanto a clonagem reprodutiva tem o objetivo de formar um embrião, clone do doador da célula somática.
Como é utilizado vírus na correção de genes defeituosos?
Serão adicionados os genes de interesse no vírus de DNA (formando o spike). Os vírus irão infectar a célula de interesse, inserindo os genes de interesse no genoma humano. Assim as células se modificarão geneticamente.
