Observations microscopiques (2) Flashcards
Quels sont les 2 types de microscopes?
Photonique (optique):
- lumière visible
- permet de voir les plus gros
Électronique:
- utilisent électrons
- obtient images très agrandit
Quels sont les 3 principaux éléments du microscope optique?
- condensateur (entre source lumineuse/échantillon)
- objectif (plus prés de l’échantillon, 1er agrandissement)
- oculaire (plus près des yeux, 2ème agrandissement)
Qu’est-ce que la limite de résolution?
La distance minimale entre 2 points qui peuvent être perçus comme étant distincts
Qu’elle est la formule de L.R.?
λ/2𝜂sin𝜃
longueur d’onde, indice de réfraction, 1/2 angle du cône de lumière
Que représente NA sur un objectif?
NA=𝜂sin𝜃
est souvent écrit directement sur le microscope
Quels sont les facteurs où l’on peut intervenir pour diminuer la limite de résolution?
- on peut diminuer la longueur d’onde (dangeurex, coûteux)
- on peut augmenter l’indice de réfraction (huile à immersion → on le met sur l’échantillon et on plonge l’objectif directement dedans)
- on peut augmenter l’angle du cône de lumière entrant dans l’objectif → sin plus grand → LR plus petit)
Quel est l’un des facteurs qui n’est pas pris en compte lors du calcul de limite de résolution?
La qualité de l’oeil de l’observateur
Qu’est-ce que le contraste?
C’est la capacité de distinguer une structure de son environnement (structure vs milieu)
Quel est l’idée du microscope à fond clair et qui l’a inventé?
- structures sombres sur fond clair (object foncé, fond clair)
- Köhler
Comment sont les préparations pour la microscopie à fond clair? Quelles sont les 4 choses qu’on peut observer avec ce type de préparations?
- elles sont à l’état frais (diminution du contraste)
- morphologie, motilité, axe de division cellulaire (protozoaires), corps d’inclusion cytoplasmiques
Vrai ou faux: tous les colorants sont vitaux?
Faux, peu de colorants permettent aux échantillons de rester en vie
Qu’est-ce qu’une coloration simple?
Un seul colorant
ex: bleu de méthylène (+), donne une coloration uniforme
Qu’est-ce qu’une coloration différentielles?
- Gram: rétentien du violet de cristal (+ violet, - rouge)
- Ziehl-Neelsen: alcoolo-acido-résistance, mycobactéries, rétention du Carbol-Fuchsine
Qu’est-ce que les colorations différentielles permettent-elles de voir?
Les structures cellulaires (endospores, capsules, flagelles, corps d’inclusion)
Quels sont les 5 microscopes photoniques?
- à fond clair
- à fond noir
- à contraste de phase
- à contraste d’interférence différentielle
- à fluorescence
Quel est le principe du microscope à fond noir?
- structures claires sur fond noir (object clair, fond noir)
- extérieur = fond clair
- visualisation de structures sans coloration ni fixation (cellules vivantes)
- différences au niveau du condensateur (la façon dont les organismes sont éclairés)
Quel est le principe du microscope à contraste de phase?
- l’extérieur est un fond clair (images sombres sur fond clair, on va mettre ensuite des filtres colorés)
- différences au niveau du condensateur et des objectifs
- principe: mise en phase de la lumière incidente
- réfraction de la lumière par les structures cellulaires → changement de phase de la lumière → changement d’intensité de la lumière (Zernike Nobel 1953)
Qu’arrive-t-il lorsqu’il y a des structures de densités différentes dans la microscopie à contraste de phase?
- réfractions différentes
- intensités lumineuses différentes
- on voit mieux l’image finale
Est-ce que les cellules sont vivantes ou non dans la microscopie à contraste de phase?
Elles sont vivantes, car on n’a pas besoin de coloration et de fixation
Qu’est-ce qu’un microscope à contraste d’interférence différentielle?
- aussi appelé microscope Nomarski
- lumière polarisée à angle variable
- réfractions différentes = modification de la polarisation
- intensités lumineuses différentes
- coloration vive et impression de pseudo-relief 3D
- différences au niveau du condensateur (système de lentilles polarisantes contrôlées par informatique)
Est-ce que les cellules sont vivantes ou non dans la microscopie à contraste d’interférence différentielle?
Elles sont vivantes, car on n’a pas besoin de coloration et de fixation. Il y a absence de halo de diffraction (contraste de phase)
Quelles sont les limites de la microscopie à contraste d’interférence différentielle?
les préparations transparentes
Quel est ce type de microscopie et pourquoi?
- microscope à fond clair (photonique)
- object foncé sur fond clair
Quel est ce type de microscopie et pourquoi?
- microscope à fond noir (photonique)
- object clair sur fond noir
Quel est ce type de microscopie et pourquoi?
- microscope à contraste de phase (photonique)
- ## différences d’intensités lumineuses → contraste
Quelles seraient des bonnes raisons pour utiliser un microscope à contraste de phase?
- étudier la mobilité microbienne
- déterminer la forme des cellules vivantes
- détecter des constituants bactériens (endospores, inclusions)
- étude cellules eucaryotes
Quel est ce type de microscopie et pourquoi?
- microscope à contraste d’interférence différentielle (photonique)
- l’image semble être en 3D et donne beaucoup d’informations
- couleurs vives
Quel est le principe de la microscopie à épifluorescence?
- certaines molécules sont excitées (lorsqu’elles absorbent une énergie radiante) et libèrent une grande partie de cette énergie sous forme de lumière
- les échantillons sont traités avec des fluorochromes (ils absorbent l’énergie du rayonnement d’excitation et fluorescent avec éclat)
- on peut déterminer les cellules vivantes (memb. cytoplasmique imperméable) des cellules mortes (memb. cytoplasmique perméable)
Qu’est-ce que l’immunofluorescence?
- L’immunofluorescence est une technique d’immunomarquage, qui utilise des anticorps ainsi que des fluorochromes. L’immunofluorescence permet de révéler une protéine spécifique directement dans la cellule, par émission de fluorescence.
- on ajoute un fluorochrome à un anticorps, si l’anticorps se lie à un antigène on va pouvoir l’observer → présence d’antigènes
Quel est ce type de microscopie et pourquoi?
- microscope à fluorescence (photonique)
- on voit des couleurs vives
- fond noir
- lumineux
Comment fonctionne le microscope à fond clair?
- l’échantillon est illuminé par-dessous et observé par-dessus
- limitations: faible contraste, résolution faible
Comment fonctionne le microscope à fond noir?
- il utilise une source de lumière alignée avec soin afin de minimiser la quantité de lumière directement transmise et de ne collecter que la lumière diffusée par l’échantillon
- augmente le contraste, faible limite de résolution
1- un cône creux de lumière est dirigé vers l’échantillon de sorte que les rayons non réfléchis et non réfractés n’entrent pas dans l’objectif
2- seule la lumière réfléchie ou réfractée par l’échantillon forme une image
Comment fonctionne le microscope à contraste de phase?
- met en valeur les différences d’indices de réfraction comme différence de contraste
- contraste excellent, mais on peut pas le faire avec des échantillons épais
1- Le système consiste en un anneau circulaire dans le condenseur qui produit un cône de lumière.
2- Ce cône est superposé à un anneau de taille similaire dans l’objectif. Chaque objectif a un anneau de taille différente, aussi il est nécessaire d’adapter le condenseur à chaque changement d’objectif.
3- L’anneau dans l’objectif a des propriétés optiques spéciales : il réduit l’intensité de la lumière directe et, ce qui est plus important, il crée une différence de phase artificielle d’un quart de longueur d’onde qui crée des interférences avec la lumière diffusée, et qui crée le contraste de l’image.
Comment fonctionne le microscope à contraste d’interférence différentielle?
1- des prismes génèrent 2 rayons de lumière polarisée dans des plans perpendiculaires à l’autre
2- un rayon passe à travers l’échantillon tandis que l’autre traverse une zone claire de la lame
3- après ce passage, les 2 rayons sont recombinés et interfèrent l’un avec l’autre pour former une image
Comment fonctionne le microscope à fluorescence?
1- une lampe à mercure produit un rayon lumineux qui passe au travers d’un filtre d’excitation
2- celui-ci transmet seulement la lumière d’excitation de la longueur d’onde désirée, qui est ensuite dirigée vers le bas du microscope par un miroir dichromatique (il réfléchit les faibles longueurs d’ondes, mais laisse passer les grandes)
3- la lumière d’excitation descend et traverse l’objectif jusqu’à l’échantillon qui a des fluorochromes
4- le fluorochrome absorbe l’énergie du rayonnement d’excitation et fluoresce avec éclat
5- la lumière fluorescente émise remonte dans le microscope à travers l’objectif (elle travers le miroir car elle a une grande longueur d’onde) et atteint un filtre qui retient toute lumière d’excitation restante
6- la lumière émise traverse le filtre jusqu’à l’oculaire
En quel année le microscope électrique a-t’il été inventé?
- 1931
- 1986 prix Nobel, Ruska
Vrai ou faux: on peut observer des virus dans les microscopes optiques?
Faux, ils sont trop petits
Pourquoi les microscopes optiques ne donnent pas les mêmes résultats que les microscopes électriques?
À cause de la nature des ondes lumineuses visibles
Quelles sont les principales limites de la microscopie électrique?
- les électrons voyagent dans le vide, donc à l’intérieur du microscope ça doit être vide (machine qui enlève la pression), les échantillons sont obligatoirement morts
- la coloration doit être faite par des matériaux imperméables aux électrons (fer, or, uranium, acide phosphotungstique)
Comment les échantillons sont-ils colorés en cryodécapage?
- Ils sont plongés rapidement dans un liquide extrêmement froid
- formation d’une glace vitreuse → préserve l’état natif des structures cellulaires et immobilise l’échantillon
Quels sont les 2 microscopes électroniques?
- à transmission
- à balayage
Quel est le principe du microscope électronique à transmission?
- électrons traversent l’échantillon
- image en 2D qu’on voit avec transparence
- la limite de résolution est diminuée, on peut donc voir des sturctures très fines
Quel est le principe du microscope électronique à balayage?
- balayage de la surface de l’échantillon
- les électrons sont réfléchis
- donne un effet 3D
- la limite de résolution est augmentée
Quel est ce type de microscopie et pourquoi?
- microscope à transmission (électronique)
- image en noir et blanc, pas très résolue, 2D
Quel est ce type de microscopie et pourquoi?
- microscope à balayage (électronique)
- 3D
- on voit très bien les structures
- on voit seulement les surfaces
Vrai ou faux: la cryoélectromicroscopie et la cryotomographie électronique permettent de conserver l’intégrité des structures dans le sous vide, grâce à la congélation rapide et donc à la vitrification de l’eau?
Vrai
Qu’est-ce que la cryoélectromicroscopie?
- modélisation des structures protéiques
Qu’est-ce que la cryotomographie électronique?
- images de strates de l’échantillon
- on détruit rien, on prend des images en coupes et on les assemblent après
- reconstruction informatique 3D
Qu’est-ce que le microscope confocal à balayage laser?
- illumination par laser
- utilisation de fluorochromes
- détection de la fluorescence
- augmentation du contraste, diminution de l’interférence
- reconstitution informatique de l’image en 3D et 4D si possible
Pourquoi utilserait-on un microscope confocal à balayage laser?
- détection/localisation d’une structure dans une cellule/tissu, etc.
- développement d’un biofilm dans le temps
- quantification/position de cellules vivantes/mortes
Qu’est-ce qu’un microscope à balayage de sonde?
- permettent d’appronfondir à l’échelle atomique
- microscope à effet tunnel
- Rohrer et Binning ont eu le prix Nobel en 1986
- une sonde balaie la surface (elle mesure le déplacement vertical/horizontal et le courant entre les nuages électroniques)
- observations en milieux aqueux
Qu’est-ce que le microscope à effet tunnel?
- 1980
- atteint des grossissement de 100 millions
- permet de voir les atomes à la surface d’un solide
Qu’est-ce que microscope à force atomique?
- a toujours une distance constante entre l’échantillon et la sonde
- permet d’étudier les surfaces qui ne conduisent pas bien l’électricité
- utilisé pour étudier les interactions entre les protéines, …
