Observations Microscopiques Flashcards
Quelle lumière utilise le microscope optique/photonique
Lumière visible
Qu’utilise les microscopes électroniques
Des électrons
Rôle de la lentille dans le microscope optique
La lentille focalise les rayons lumineux vers le foyer en utilisant la réfraction de là lumières
Formule de l’agrandissement du microscope optique
Objectif x oculaire
Agrandissement maximum du microscope optique
3000x
Formule de la limite de résolution
LR= longueur d’onde / (2x indice de réfraction du milieuxsin•)
Def limite de résolution
Distance minimale entre 2 points qui peuvent être perçus en étant distincts
Comment diminuer la limite de résolution et augmenter la résolution ?
- on ne peut pas changé sin• car il est constant
- on peut diminuer la longueur d’onde MAIS les UV ne peuvent pas passer dans le condensateur en verre + UV dangereux pour les yeux + il faut transformer les UV transmis dans la lumière visible
- augmenter l’indice de réfraction du milieu: on utilise de l’huile à immersion pour limiter les vaisseaux lumineux
Que les sont les diff types de microscopes optiques ?
- microscope a fond clair
- microscope a fond noir
- microscope a contraste de phase
- microscope a contraste d’interférence différentielle
- microscope a (épi)fluorescence
-microscope confocal à balayage laser
Caractéristiques du microscope
Présence d’un condensateur, objectif et oculaire
Rôle du condensateur
Moduler les faisceaux de lumière sur l’échantillon
Rôle de l’oculaire
Permet d’observer l’échantillon et produit un grossissement initial
Rôle de l’objectif
Permet d’agrandir l’image
Définition de contraste
Capacité à distinguer une structure de son environnement
Caractéristiques de microscope a fond clair
L’échantillon est placé directement sur la lamelle: préparation a l’état frais
Utiliser pour des microorganismes de grandes taille.
Les cellules sont vivantes, on peut observer leur morphologie, leur motilité, leur division
Limite du microscope a fond clair
Les cellules vivantes ne sont pas clairement visibles car le contraste entre l’eau et les structures cellulaires est faible
Comment augmenter le contraste ?
Utiliser des colorants qui exigent fixation, séchage
Les cellules ne sont donc plus vivantes et peuvent être altérées
Caractéristiques et exemples des colorants
Molécules chargées ou hydrophobes qui adhèrent à la cellule
Ex: coloration uniforme (1 seule couleur) -> bleu de méthylène
Coloration différentielle (différentes couleurs pour différentes structures-> coloration gram’+/-
Coloration alcoolo-acido-resistante -> permet de savoir si l’échantillon contient des mycobacteries
Quel type d’observation avec une coloration différentielle ?
On veut DIFFÉRENCIER certaines cellules/bactéries par leur caractéristique:
- présence d’endospores
-présence de capsule
-présence de flagelles
- présence de corps d’inclusion (réserves à l’intérieur du cytoplasme
Caractéristiques du microscope a fond noir
Un écran est placé sous le condensateur à lentille convergente. Le condensateur produit un cône creux de lumière.
La seule lumière qui entre dans l’objectif provient de l’échantillon
On observe des structures lumineuses sur fond noir
Les cellules sont vivantes
Caractéristiques du microscope a contraste de phase
Un anneau de phase sur le condensateur concentre la lumière sur l’échantillon. La lumière déviée par l’échantillon est déphasée et celle qui passe à côté(non déviée) passent à travers l’objectif vers la lame de phase qui met en phase. Le microscope change ces différences de phases en différences d’intensité lumineuse. On observe des images sombres sur fond clair avec un halo lumineux auteurs de l’échantillon. On peut voir des structures plus fines et les cellules sont vivantes
Caractéristiques du microscope a contraste d’interférence différentielle
Détecte les différences d’indice de réfraction et d’épaisseur. Des prismes génèrent 2 rayons de lumière polarisée: 1 rayon passe dans l’échantillon (modification dès la polarisation) et l’autre passe dans une zone claire. Les 2 rayons sont récombinés. Le microscope traduit ces différences de polarisation par une différence d’intensité lumineuse.
Au niveau du condensateur il y a des lentilles polarisantes.
Coloration vive et pseudo relief
Observation de cellules vivantes
Caractéristiques du microscope a epi(fluorescence)
Une lampe à mercure produit une lumière UV qui est dirigé vers l’objectif par un miroir dichromatique et qui excite un échantillon (dans l’épi fluorescence l’échantillon est illuminé par le haut plutôt que par le bas) traite avec des fluorochromes. Ces fluorochromes émettent une lumière visible.
L’objectif doit être en quartz pour les UV.
Buts et utilisation du microscope a fluorescence
- distinction des cellules vivantes et mortes (fluorochromes vitaux)
-immunofluorescence (anticorps couples à des fluorochromes)
-détection spécifique d’une espèce: Fish (molécule d’ADN couplée à des fluorochromes) permet de quantifier une espèce sans avoir à faire de culture.
Caractéristiques générales du microscope électronique
Les électrons ne traversant ni le verre ni le quartz -> des lentilles magnétiques dévient les faisceaux d’électrons: electro aimants
Les électrons ne se déplace pas dans l’air mais dans le vide-> l’échantillon est mort
On retransmet la lumière des électrons sur des écrans détecteur: écran fluorescent
Comparaison de la résolution du microscope photonique et électronique
Photonique: 0,2 micromètre
Échantillon: 0,5 nanomètre
Pouvoir de grossissement microscope optique et électronique
Photonique: 1000x
Électronique: 400 000x
Limite du microscope électronique
Les électrons ont un faible pouvoir pénétrants, les objets doivent être très fins, techniques de fixation pour obtenir un bloc solide-> altérations
Le faisceau d’électron interagit peu avec la matière-> faible contraste
Technique d’ombrage
Valorisation d’une fine couche de métaux lourds avec un angle précis. Le relief génère des ombres
On peut mesurer l’élévation de l’échantillon en comparant les ombres de l’échantillon et celle d’une bille de taille connue
-> étude dès la morphologie des virus, flagelle, ADN
Différente technique pour augmenter le contraste dans un microscope électronique
Technique d’ombrageux
Coloration négative
Cryodecapage
Immuno localisation cellulaire
Coloration négative
On fait tremper l’échantillon dans de l’acide phosphotungstique. Les métaux lourds pénètrent dans les creux qui apparaissent sombres et les reliefs apparaissent clairs
-> étude des structures et du relief des microorganismes
Cryodecapage
Congélation de l’échantillon (-180C) puis fracture aux zones de faiblesse -> coupe transversale pour observer l’intérieur de la cellule
Après on réalise une technique d’ombrage métallique pour voir le relief à l’intérieur de la cellule
Immuno localisation cellulaire
Couplage entre anticorps et billes de fer ou d’or. Lorsqu’on observe une bille sombre au microscope on sait qu’il y a l’anticorps donc la protéine virales/spécifiques à cet anticorps
Microscope électronique à transmission (MET)
Les électrons traversent l’échantillon
Le détecteur est sous l’échantillon -> image par transparence
Limite de résolution très petite pour voir des structures très fines
Microscope électronique à balayage (MEB)
Le faisceau d’électron balaye la surface de l’échantillon
Le détecteur est latéral -> effet 3D
Limite de résolution plu élevée
Pourquoi utiliser des microscopes à transmission utilisant le froid
Éviter les altérations liée à la fixation de l’échantillon
Méthode de préparation des microscopes utilisant le froid
Congélation rapide -135C dans de l’éthane ou de l’azote liquide
Vitrification de l’eau pour éviter les cristaux
Les structures sont conservées sous vide mais il faut que le microscope soit à température très basse
2 types de microscopes à transmission utilisant le froid
Cryoelectromicroscopie
Cryotomographie: les images de l’échantillon sont prises selon divers points de vue -> capture de découpe et reconstitution informatique 3D
Microscope confocal à balayage laser
Microscope photonique
Utilisation de laser UV et de fluorochromes
Une ouverture au dessus de l’objectif bloque les rayons parasites et on capte seulement un plan précis
Balayage du laser: horizontal, vertical, temporel
Numérisation de l’image 3D ou 4D
Applications du microscope confocal à balayage laser
- détection d’une structure dans une cellule/ tissus
- développement d’un biofilm dans le temps (avec des fluorochromes vitaux)
- quantification de cellules vivantes et mortes (avec des fluorochromes vitaux)
Microscope à balayage de sonde
Ni photonique ni électronique
Détermine le caractère de surface en déplaçant une sonde sur l’echantillon
Microscope a effet tunnel
La sonde est ABC jusqu’à ce que son nuage électronique touche celui des atomes de surface. On peut mesurer le déplacement vertical et horizontal. Grossissement: 10^8
Permet de visualiser les liens intermoléculaires même immergé dans l’eau (étude de l’ADN)
Microscope à force atomique
La sonde est constitué d’une pointe très fine positionnée à l’extrémité d’un levier quand la pointe est à proximité d’une surface les force d’interaction pointe/échantillons entraînent une déviation du levier. On peut étudier les surfaces qui ne conduisent pas l’électricité. On visualise les interactions entre protéines, les comportements de la cellule et on peut visualiser les protéines membranaires.
