Nutrientes de los medios de cultivo Flashcards
¿Cuáles son los macronutrientes?
Nitrógeno (N)
Fósforo (P)
Potasio (K)
Calcio (Ca)
Magnesio (Mg)
Azufre (S)
Nitrógeno
- Elemento más importante.
- Posee carácter constructivo de las principales biomoléculas.
- Suministrado en forma de nitrato (NO−3 ) o de amonio (NH+ 4 ).
- Puede causar vitrificación (hiperhidricidad).
Fósforo
- Indispensable en la fotosÍntesis, la respiración y en todo el metabolismo.
- Forma parte del ATP.
- Parte estructural en muchas moléculas y estructuras celulares, por ejemplo: enlaces diéster (ácidos nucleicos) y en los fosfolípidos (membranas).
Deficiencia –> tamaño reducido y coloración rojiza.
Potasio
- Elemento más abundante en las vacuolas
- Actúa como osmoregulador y regula el pH
- Activador de sistemas enzimáticos (oxidorreductasas, deshidrogenasas, transferasas, sintetasas y quinasas).
- Promueve el crecimiento del tejido meristemático
Calcio
- Estimula el desarrollo de raíces y hojas.
- Es un componente de la pared celular
- Puede inhibir otras enzimas al utilizar concentraciones mayores de 1μM
Deficiencia –> muerte de meristemos.
Magnesio
*Se encuentra principalmente en los cloroplastos
20 % en la clorofila
*Importante en la activación de moléculas como rubisco, fosfoenol-piruvato carboxilasa y glutamato sintasa
Deficiencia –> clorosis de hojas maduras
Azufre
*Forma parte estructural de la cisteína (aa esencial en el metabolismo del azufre).
*Componente de algunas proteínas y enzimas.
Deficiencia –> hojas cloróticas
Micronutrientes (oligoelementos)
Hierro (Fe)
Manganeso (Mn)
Zinc (Zn)
Cobre (Cu)
Boro (B)
Molibdeno (Mo).
Fuentes de carbono
Carbohidratos agregados al medio –> afectan fuertemente el crecimiento y la morfogénesis, porque:
a) Proporciona carbono a una plántula con fotosíntesis deficiente (heterotrofía) por el: *débil desarrollo de las hojas
*Intercambio limitado de gases
*Alta humedad relativa.
b) Participa en la variación del potencial osmótico.
Aproximadamente 1/3 del costo de producción
Ejemplo de las fuentes de carbono
Fructosa
*Promueve el crecimiento de brotes y es fácil de descomponer
*Genera hiperdricidad, clorosis y no promueve la diferenciación de tejidos
Maltosa
*Acelera la división celular y funciona como agente osmótico
*Costos elevados y a una mala concentracion inhibe el crecimiento
Glucosa
*Provee energía más rápido y mayor produccion de metabolitos
*niveles elevados ocasionan estrés oxidativo
Sucrosa
*Regula la presión osmótica, promueve la absorcion de nutrientes y el enraizamiento
*Costos elevados y puede generar vitrificación
Vitaminas
- Actúan como catalizadores en vías bioquímicas esenciales para el crecimiento vegetal.
- La Tiamina (B1) es indispensable y se asocia con la citoquinina, promoviendo el crecimiento y enraizamiento de callos.
¿Cómo se agregan las vitaminas a los medios de cultivo?
Otras vitaminas usadas en ciertos medios:
Biotina (H): Importante para el desarrollo de callos.
Riboflavina (B2): Ayuda en el enraizamiento.
Vitamina D: Absorción de calcio y división celular.
Vitamina C (Ácido ascórbico): Propiedades antioxidantes, mejora el crecimiento y enraizamiento.
Ácidos usados:
Ácido fólico
Ácido pantoténico
Ácido p-aminobenzoico
¿Para que sirven los Aminoácidos?
- Las plantas sintetizan para un crecimiento óptimo
- Adición externa es crucial en cultivos de células y protoplastos.
- Proveen una fuente rápida de nitrógeno, más asimilable que las fuentes inorgánicas.
¿Cómo se agregan los aminoácidos a los medios de cultivo?
- Hidrolizado de caseína
- L-glutamina
- L-asparagina (100 mg/L)
- Adenina
- Glicina (2 mg/L)
- Glutamina (hasta 8 mM)
- L-arginina y cisteína (10 mg/L)
- L-tirosina (100 mg/L)
¿Para qué se agregan los agentes Gelificantes ?
No aportan nutrientes, pero permiten la distribución uniforme de estos en el medio sólido.
Ejemplos de agentes gelificantes
- Agar
- Alternativas:
*Gelatina, gel de sílice, goma gellan (favorece el estudio de las raíces).
*Menor costo: Almidón de patata, polvo de arroz, harina blanca (hasta 70% de reducción de costos).
Características del Agar
- Concentración óptima: 0.8 - 1.0% (p/v)
- Forma geles estables, no interactúa con el medio y no es degradado por las plantas.
- Se funde fácilmente (60-100 ° C) y se solidifica aproximadamente a 45 ° C → gel estable a todas las temperaturas de incubación factibles.
¿Cuáles son los Antibióticos usados en los medios de cultivos y que tipo de bacterias atacan?
- Carbenicilina: efectiva contra grampositivas, gramnegativas
- Cefotaxima: efectiva contra grampositivas, gramnegativas
- Cloranfenicol: efectiva contra todo alv.
- Gentamicina: efectiva contra todo excepto micobacteria
- Sulfato de Kanamicina: efectiva contra todo excepto micobacteria
- Penicilina: gram positivas y negativas
Antimicóticos
- Pentacloronitrobenceno: efectivo contra moho
- Tiabendazol: efectivo contra moho
¿Qué hacen los Antioxidantes?
Un antioxidante es capaz de donar sus electrones a los radicales libres (p.ej. oxígeno singlete, O2), neutralizándolo en una molécula estable (O2).
Los radicales libres pueden matar a la célula, ¿Cómo sucede esto?
- Un radical libre (RADICAL A) se encuentra con otra molécula (MOLÉCULA 1) diferente a un antioxidante (p. ej. proteínas, o nucleótidos)
- ‘Arranca’ uno de sus electrones de valencia para poder neutralizar su carga.
- Ahora, será la molécula 1 la que tenga un electrón desaparcado, y por tanto se convierta en el siguiente radical libre (RADICAL 1)
- Esto conduce a una reacción en cadena radicalaria.
Efectos de la polifenol oxidasa
- Cataliza la oxidación a diferentes compuestos fenólicos, con la consecuente transformación a pigmentos oscuros no deseables para la calidad industrial.
Pardeamiento enzimático (PE)
Ejemplos de antioxidantes
- Ácido ascórbico
- Ácido Cítrico
- L-cisteína
- Polivinil pirrolidona (PVP)
Se caracterizan por tener enlaces dobles, lo que les permite donar un electrón, sin pasar a ser radical libre (enlace doble–> enlace sencillo)
Explante
Trozo de tejido vegetal que se coloca en un cultivo de tejidos.
*Puede desarrollar un callo como respuesta a la herida.
*Tipo de respuesta deseada= La elección del tejido del explante variará.
Cualquier trozo de tejido vegetal puede utilizarse como explante
Callo
Es un conjunto de células desorganizadas que se dividen.
*Las células varían en tamaño, forma, pigmentación y, a veces, en expresión genética.
*Tienen una gran vacuola central y el núcleo está a un lado.
callos sin herir = Se germinan semillas en un medio con regulador del crecimiento (2,4-D.)
Edad del explante
Joven = mejor respuesta in vitro.
Joven = más fácil desinfectar la superficie y establecer cultivos limpios.
Viejo = no formará callos capaces de regenerarse.
Tamaño del explante
*Cuanto más pequeño =más difícil cultivarlo.
*El medio debe tener componentes
adicionales
*Grandes = probablemente contengan más reservas de nutrientes y reguladores del
crecimiento de las plantas para sostener el cultivo
*Las plantas tienen distintos equilibrios hormonales en sus partes,por lo que puede tener un nivel endógeno diferente de reguladores del crecimiento vegetal
Genotipo
*Los genotipos, cultivares o especies varían en su respuesta al cultivo celular.
*Algunos genotipos no responden o son recalcitrantes, mientras que otros producen callos o brotes fácilmente.
*Probar varios genotipos es esencial para identificar los que responden bien en cultivo.
¿Qué se tiene que tomar en cuenta para la preparación de medios de cultivo?
Condiciones clave:
- Composición del medio de cultivo
- Factores ambientales
- Esterilidad:
Algunos componentes de los medios que son inestables a altas temperaturas, deben esterilizarse mediante ultrafiltración a temperatura ambiente. ( hormonas, enzimas) Por lo general, se esteriliza un pequeño volumen al pasarlo a través de una unidad de filtración de membrana conectada a una jeringa graduada.
Explante según su propósito
Propagación clonal
Yema o brote lateral o terminal.
Inducción del callo
Cotiledón, hipocotilo, tallo, hoja o embrión. (excelentes los tejidos de plántulas de semillas germinadas asépticamente o de inflorescencias inmaduras.)
Plantas haploides o callos
antera o el polen.
Tipos de contaminantes en el cultivo in vitro
Bacterias
*Mas comunes entre los microbios contaminantes de tejidos vegetales in vitro
Hongos
*Contaminantes externos de los explantes (algunos asociados con el sistema vascular)
Bacterias
Bacterias vitropatógenas con mayor incidencia: Acinbacter, Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Enterobacter, Lactobacillus, Pseudomonas, Staphylococcus y Xanthomonas.
Síntomas más comunes: Muerte del explante, crecimiento irregular, necrosis, baja multiplicación en brotes y poca capacidad de enraizamiento.
Identificación:Manchas acuosas en el tejido, turbidez en medios líquidos y colonias circulares en medios semisólidos.
Hongos
Géneros comunes: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Penicillium y Saccharomyces (levaduras).
Síntomas: crecimiento micelial rápido que cubre el explante y causa la muerte de los tejidos.
Las levaduras pueden confundirse con contaminaciones bacterianas.
Fuentes de contaminación
Materia vegetal
Aire
Operario
Material vegetal
*Microbios e insectos viven en las plantas sin causar daño, pero en condiciones in vitro se vuelven vitropatógenos.
*Estos microorganismos suelen encontrarse en cavidades de la corteza y en órganos, dificultando la acción de las soluciones desinfectantes.
Algunos están asociados al sistema vascular, complicando aún más su eliminación.
¿Por qué es Aire es una fuente de contaminación?
*Contiene partículas como polvo, esporas, bacterias y ácaros que pueden contaminar los cultivos.
*Para reducir este riesgo, es crucial asegurar una buena calidad del aire en el entorno de cultivo.
¿Cómo el Operario puede contaminar los cultivos?
*Microbiota de la piel
*Desprendimiento de células muertas del cuerpo
*Manipulación indebida
*Fallas comunes = Uso de utensilios contaminados, hablar durante el trabajo, mala colocación de herramientas, calentamiento insuficiente de instrumentos y subcultivo de tejidos ya contaminados.
Protocolo de preparación de medios de cultivo para tejidos vegetales
- Preparación de soluciones separadas de macronutrientes y micronutrientes:
-
Adición de componentes adicionales (hormonas, sacarosa, agar):
Hormonas (auxinas, giberelinas, citoquininas, etc.) se añaden según sea necesario. -
Ajuste del volumen final:
Completa el volumen final con más agua destilada. -
Ajuste del pH del medio:
Utiliza NaOH 0.1 N o HCl 0.1 N para ajustar el pH a 5.7.
Nota: El pH es crítico, ya que un pH incorrecto puede afectar la disponibilidad de nutrientes y el crecimiento de los tejidos. -
En caso de usar medio comercial:
Si usas un medio premezclado, disuelve adecuadamente el agar calentando la solución. -
Dispersión del medio en recipientes de cultivo:
Vierte el medio preparado en tubos o frascos de cultivo, cubriendo con tapones de algodón no absorbente. -
Esterilización:
Esteriliza los frascos o tubos con el medio en un autoclave a 121°C y 15 psi por 15 minutos. -
Enfriamiento:
Deja enfriar a temperatura ambiente antes de usar.
Notas para la preparación y mezcla de soluciones separadas de macronutrientes y micronutrientes
- Realiza las disoluciones de ambos grupos de nutrientes en agua destilada para asegurar que los componentes no se precipiten o se degraden.
- Agrega la cantidad adecuada de ambas soluciones a la cantidad inicial de agua destilada y mezcla bien para homogeneizar.
¿Qué es importante tomar en cuenta en al agregar los componentes adicionales?
Los promotores del crecimiento como las auxinas deben agregarse después de la esterilización para evitar su degradación por el calor.
Importancia de la Esterilidad
Los tejidos vegetales son muy susceptibles a la contaminación por bacterias y hongos, que pueden competir con el tejido vegetal por los nutrientes y destruir los cultivos.
¿Qué tipo de desinfectantes se usan para la esterilización de superficies (explantes)? y
¿Cuánto dura ?
Los explantes se esterilizan utilizando desinfectantes como hipoclorito de sodio, etanol o fungicidas.
La duración de la esterilización varía según el tipo de tejido; los tejidos de las hojas requieren tiempos de exposición más cortos que las semillas con cubierta dura.
¿Cuando, Para qué y como se usa la campana de flujo laminar ?
Cuando –> Durante todos los procedimientos de cultivo de tejidos
Para qué–> Filtra el aire utilizando filtros de polvo y filtros HEPA (High-efficiency Particulated Air)) para crear un entorno de trabajo estéril.
Cómo –> Es necesaria una limpieza regular con alcohol al 70 % para mantener la esterilidad.
Limpieza de material
Aparte del lavado, se puede aplicar la esterilización por autoclave o con agentes químicos.
Hipoclorito de sodio (cloralex)
Hipoclorito de calcio
Peróxido de hidrogeno
Desinfección del explante
- Colocar el material en una solución de alcohol etílico al 70% antes de tratarlo con otra solución desinfectante.
*Agente humectante, como el tween 20 o 80 a los desinfectantes para reducir la tensión superficial y permitir un mejor contacto con la superficie. - Resulta mejor un procedimiento de esterilización de dos pasos:
1.Etanol
Tween
2. “Cloro”
Hipoclorito de sodio a una concentración de 0.5-5% durante 5-30 min.
