MolMed AK Flashcards

1
Q

Nenne die wesentlichen Schritte bei einer Genexpressionsanalyse mittels eines Arrays.

A
  1. Probenisolation
  2. Isolierung der Nukleinsäuren
  3. Markierung und Amplifikation (behanldet/nicht behandelt)
  4. Chip-Hybridisierung
  5. Detektion
  6. Datenauswertung
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2
Q

Unterscheide Illumina und Pacific Bio Science

A

Illumina:
es kann immer nur eine Base hinzugegeben werden, Kopien werden abgelesen, Clusterbildung, Bridge, Amplification

Pacific:
alle Basen können gleichzeitig abgelesen werden, keine Kopie, Real Time Sequenzing

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3
Q

Welches Sequenzierverfahren ist am schnellsten?

A

Pacific Bio Science, Nanopore

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4
Q

Formulieren Sie zwei Reaktionen, Verfahren mit kovalente Bildung eines Nukleinsäurestranges an eine Oberfläche. Erläutern sie eine Möglichkeit nicht zur kovelenten Fixierung an eine Oberfläche, wie könnte das kontrolliert werden?

A
Epoxide an der Oberfläche:
daran kann Thiolgruppe kovalent binden
- Epoxide oder Maleimide -> Reaktivsystem
  Epoxide über HS-R^3 zu SR^3-OH
  Meleimid über HS-R zu SR-

Maleimide:
kovalente + selektive Anbindung von Thiolen. Erlaubt auch andere basische Funktionalitäten im bioaktiven Molekül, die hier nicht gebunden werden. Milde Bedinungen - quantitativ

N-Hydrosuccinimid (NHS) Ester:
kovalente Anbindung Amine, Alkohol. Umsatz, rel milde Bedingungen

nicht kovalent: Basenpaarung (komplementär)
-> Basen floureszens markieren

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5
Q

Aus welchen prinzipiellen Komponenten besteht ein Massenspektrometer

A

Ionenquelle:
Proben Moleküle sind isonisation, chemisch, Elektrospray, MALDI (=Matrix–Assistierte Laser–Desorption–Ionisierung) der Substanzen

Massenanalysator:
Ionen nach Masse/Ladungsverhältnis aufgeteilt (time-of-flight), Ion Trap

Massendetektor:
Nachweis der Ionen die zuvor vom Analysator sortiert wurden

Daten Aquisierungs Units: sammelt Daten
- schwere Massen werden weniger abgelenkt

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6
Q

Welche Infos sind einem Spektrometer einer Substanz zu entnehmen mit Erläuterung?

A

Masse des Moleküls durch die Indentifizierung des Moleküls

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7
Q

Wovon hängt der Informationsgewinn bzw. die Art der Information ab in Bezug auf das Ionisationsverfahren?

A

Wahl der Methode ist von der zu analysierenden Substanz abhängig und wie schonend diese ionisiert werden soll

Bsp.: Elekrospray ist eine schonende Methode um biologische Moleküle zu ionisieren.
Zu starke Ionisation = Informationsverlust durch Zerstörung der Moleküle

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8
Q

Was versteht man unter Affibodies?

A
  • Affibodys sind künstliche, vom Protein A aus dem Bakterium Staphylococcus aureus abgeleitete Peptide, die zur Bindung von Antigenen befähigt sind. Sie bestehen aus 58 AS der IgG-Bindungsdomäne von Protein A, die in drei α-Helices angeordnet sind.
  • Ähnlich wie AK, nur billiger
  • kleines molekulares Gewicht und strukturelle
    Stabilität
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9
Q

Vorteil und Nachteil von:

Bindung eines Aminoglykosidantibiotikums bei Affibodies

A

Vorteil:
Affibody erkennt Erreger, Antibiotikum bekämpft den Erreger direkt. Geringe Nebenwirkung durch die gezielte Wirkung am Erreger

Nachteil:
teuer, langwierige Herstellung

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10
Q

Vorteil & Nachteil von:

Bindung von Thromben bei Afibodies

A

Vorteil:
Markierung der Thromben & evtl. Beseitigung der Thromben durch Medis

Nachteil:
teuer, langwierige Herstellung, währden die Thromben größer werden

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11
Q

Warum sind Mutationen in bösartigen Zahlreich?

A

Reperaturmechanismen werden immer mehr ausgeschaltet –> keine Apoptose & Zellzykluskontrolle mehr

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12
Q

Zwei Bsp. von häufig auftretenden Veränderungen

A

Mutation bei ras, p53, Tyrosinkinasen

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13
Q

Zwei konkrete Bsp. von Mutationen

A

p53:
vermehrte Proliferation aber keine Differenzierung der Zellen

Gain of function:
JAK-2 Mutation bei Polyzythämina Vera: Mutation der Thyrosinkinase EPO-Rezeptor wird verändert, Zellen werden sensitiver gegenüber EPO –> Eryvermehrung

Loss of function:
BCR-ABL Mutation bei chr. myeloischer Leukämie:
durch Translation zw. Chromosom 9 und 22 -> veränderte Tyrosinkinasewirkung -> unkontrollierte Proliferation der myeloischen Blutzellen

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14
Q

Was sind die Ergebnisse und Konsequenzen von einer Konzentrationszunahme von p53?

A

Ergebnisse:
Hyperpoliferative Signale, DNA-Schädigung, Telomerverkürzung, Hypoxie

Konsequenzen:
Stopp des Zellzyklus, Zellalterung, Apoptose

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15
Q

Welche Typen an Tyrosinkinasen kennen Sie?
Warum ist das Design selektiver Tyrosinkinasehemmstoffe schwierig, anderseits in der Tumortherapie auch nicht unbedingt Voraussetzung ggf. auch Vorteil?

A
  • Rezeptor- und Cytoplasmatische Tyrosinkinasen
  • Kinasehemmer (Medis bei Tumortherapie) stoppen die Zellproliferation
  • Tyrosinkinasen kmmen auch in anderen Mechanismen vor, sind ähnlich aufgebaut und deshalb wurde die Anwendung mehrere Mechanismen hemmen
  • zu einem Tumor kommt es nicht nur, wenn die Tyrosinkinase mutiert ist, sondern hat auch noch andere Gründe
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16
Q

Welche Sequenzierungsverfahren beruhen alle auf der Synthese eines Nukleinstrangs?

A

Ion Torrent, Pacific Bio Science, Sanger

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17
Q

Welche Merkmale haben Illumina und Pacific gemeinsam?

A

Sequenzierung über Synthese

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18
Q

Welche Aussage ist richtig?
1) typisches Amplifizierungsverfahren bei Illumina kommt es zur Ausbildung von Clustern

2) Die Clusterdichte darf zu hoch sein aber nicht zu niedrig
3) eine höhere Clusterdichte lässt sich durch kleinere Fragmente erreichen
4) eine passende Clusterdichte lässt sich durch die Konzentration der zu amplifizierenden Fragmente (Bridge Amplification) einstellen

A

1) typisches Amplifizierungsverfahren bei Illumina kommt es zur Ausbildung von Clustern
4) eine passende Clusterdichte lässt sich durch die Konzentration der zu amplifizierenden Fragmente (Bridge Amplification) einstellen

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19
Q

Welche Sequenzierung ist von Homopolymeren gut geeignet?

A

Illumina, Sanger, Pacific

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20
Q

Welche Sequenzierung beruht auf Echtzeit?

A
  • Oxford Nanopore

- Pacific Bio Science

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21
Q

Welche Sequenzierungdverfahren sind für die Sequenzierung von Homopolymeren besser und welche schlechter geeignet?

A

Besser:

  • Sanger (Schrittweise, bei jeder Base ein Signal)
  • Illumina (ein Nukleotid wird gebunden und die genaue Länge der Homopolymere wird bestimmt)
  • Pacific (jedes einzelne Nukleotid wird detektiert)

Schlechter:

  • Ion-Torrent (ermöglicht parallele & simultane Detektion unabhängiger Sequenzierungsreaktionen, was schlecht für Homopolymeren ist)
  • Nanopore
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22
Q

Wann sind DNA-Veränderungen durch Karzinogene kritisch?

A

Wenn sie repliziert und nicht korrigiert werden. Wenn sie Tumorsuppressor (p53) und Onkogene (ras) betreffen

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23
Q

Was ist die Definiton von Epigenetik?

A

Regulation der Genexpression durch Modifizierung der Histonenproteinen

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24
Q

Nenne eine epigenetische Veränderung + Bsp.

A

Epigenetik betrifft die Methylisierung (führt zu Chromatinverdichtung)
-> Bsp.: Tumorzellen methylieren Gene von Tumorsupressorproteinen

& Acetylierung (führt zu Öffung des Chromatins)
-> Bsp.: Acethylierung von Histonen, DNA, begünstigt das ablesen

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25
Q

Wie wird Faktor 8 Mangel vererbt und welche Familienmitglieder sind ggf betroffen?

A

Hämophilie:

  • x-chromosomal rezessiv vererbt, eher Männer als Frauen betroffen, da Frauen zwei x Chromosome haben, die den Mangel ausgleichen können
  • Hämophilie A: Gerinnungsfaktor VIII fehlt
  • Hämophilie B: Gerinnungsfakrot XI fehlt
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26
Q

Entwerfen Sie einzelne Komponenten und deren Funktionen eines Nachweissystems welches aus einem Aptamer-fungierten Molekular-beacon besteht und die Konzentration des zu bestimmenden Moleküls mit der Intensität eines immobilisierten Signals korreliert.

A
  • quantifizieren aus Speichel, Plasma
  • je mehr Moleküle, desto intensiver wird das Signal
  • wenn sich das Beacon öffnet kann man das Signal des Target Moleküls detektieren
  • geöffneten Beacon Strang fixieren: Bindungen und Affinitäten beachten; dürfen nicht zum komplementären Strang stärker sein als zum Zieltarget
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27
Q

Welches Sequenzierverfahren beruht auf Echtzeit?

A

Oxford Nanopore und Pacific

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28
Q

Welche Sequenzierung von Homopolymeren ist gut geeingnet?

A

Illumina und Sanger

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29
Q

Wie kann man Aptamere chemisch stabilisieren?

A
  • Oligonucleotide von Target/Substrat
  • Enantiomere
  • Einführung von F Gruppen in NS
  • Intramolekulare Etherbrücken Position
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30
Q

Was ist der Unterschied von der Bindung eines Aptamers zu einem AK?

A

AK: Schlüssel-Schloss-Prinzip, gleiche Bindungstypen

Aptamere: 3D Interaktion mittels Van-der-Waals & WB

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31
Q

WIe unterscheiden sich Gefäße von Tumoren zu normalen Gefäßen?

A
  • wachsen unoganisiert & stark gewunden
  • haben Wandstruktur, welche an Kapillaren erinnert / besitzen eine inkomplette Basalmembran –> Gefäße nicht Druckstabil
  • besteht hauptsächlich aus Endothelzellen, keine Peryzten (Bindegewebszellen)
32
Q

Erläutern Sie in Stichworten die wesentlichen exp. Schritte bei einer Genexpressionsanalyse mittels eines Arrays.

A
  • Zelllyse
  • mRNA aus den Zellen extrahieren
  • mRNA in cDNA mittels reverse Transkriptase konvertieren (stabiler)
  • auf Array geben, wo es mit der DNA bindet (komplementäre Hybridisierung)
  • -> Vergleich zw. behandelt/nicht behandelt oder krank/gesund
  • Laser führt zur Anregung -> Farben geben Auskunft ob krank/gesund
33
Q

Welche Vorteile besitzt Illumina gegenüber Affymetrix?

A
  • bei Illumina können mehr Proben durchgeführt werden
  • Affimetrix ist qualitativ schwieriger, da sich die Werte aus einzelnen zusammensetzten, welche für jeden Gen reproduzierbar sein muss
34
Q

Zwei unterschiedliche Bsp. für wissenschaftliche Problemstellungen bei welchen Sie bevorzugt ein Sequenzierverfahren / Array-Verfahren anwenden würden + Begründung

A

Array:
Brustkrebs -> um Vorhersagen zu können wie hoch das Risiko spez. Formen von Brustkrebs zu bekommen/wiederauftreten

Sequenzierung:
ungeborenes Kind eine Genommutation hat, da eine Sequenzierung sensitiver als ein Array ist

35
Q

Definiere die Begriffe homozygot und heterozygot

A

homozygot.:
gleiche Allele im Genotyp, reinerbig

heterozygot:
unterschiedliche Allele im Genotyp; mischerbig

36
Q

Was sind Genotyp- bzw. Haplotyp-Frequenzen?

A

Geno.:
relative Anteil einzelner Genotypen in der Population

Halo.:
Frequenz, an einer Position, von 2 / mehr Allelen an unterschiedlichen Loki

37
Q

Was versteht man unter Elektronenspray Ionisation und welche Verwendung hat dies?

A
  • Analytlösung wird durch eine Metallkapillare geleitet –> an der Spitze ist eine Spannung angelegt
  • ->Technik zur Erzeugung von Ionen unter Atmosphäredruck
  • wird verwendet zur Analyse von Biomolekülen, da es sehr schonend ist und es kaum zu einer Fragmentierung kommt
38
Q

Was versteht man bei der Massenspektrometrie unter MALDI?

Messungsprinzip? Was ist der Hauptanwendungsbereich und warum?

A

MALDI = Matrix Assistierender Laser Desorbiert/Ionisiert; extrahiert die Ionen von der Probenoberfläche

  • beruht auf der Co-Kristallisation von Matrix und Analyt –> Analytmoleküle müssen in Kristalle der MALDI Matrix eingebaut werden
  • Nutzung: Identifikation von Bakterien
  • Probe wir in niedermolekulare MAtrix gegeben & mit Laser beschossen –> Absorption der Laserstrahlung -> in Matrix E-reiche IIonen werden gebildet und geben E an die Probe ab, welche in Fragmente zerfällt –> Beschleunigung & AUftrennung , da kleine & leichtere Fragmente schneller am Detektor aufkommen
39
Q

Wie könnte eine Proteinsequenz Massenspektrometrie ermittelt werden? Machen Sie eine begründeten Vorschlag für ein für ein Verfahren.

A
  • mittels Proteasen, Protein zerlegen und in Peptide einschließen –> Chromatographie
  • Sequenz mittels Massenspektometrie gewinnen
40
Q

Welche prinzipiellen methodischen Alternativen/Ergänzungen hat man heute zur Karyotypisierung und zur Entdeckung genomischer Erkrankungen?
Erläutern sie kurz Grundlagen und Voraussetzungen zweier Verfahren und erläutern Sie potentielle Vorteile.

A
  • FISH, Sequenzierung und Arrays

FISH:
Nachweis von Chromosomenabschnitten durch floureszierende Sonden, welche an bestimmte Genabschnitte binden; Chromosome müssen sich hierfür in der Metaphase befinden

Vorteil:
Defekt kann direkt lokalisiert werden; man weiß ob nur ein Chromosom oder beide betroffen sind

Sequenzierung:
wenig Template ist notwendig um Chromosommutationen ausfindig zu machen

41
Q

Beschreibe den Unterschied zw. dominant und rezessiv.

Was ist die minimal Voraussetzung für eine Krebserkrankung?

A

Onkogene:
sind dominant; gain of function Mutation
-> eine Kopie des krebskritischen Gens mutiert, was zu Krebs führen kann
-> Adenomatodr

Tumorsuppresorgene:
sind rezessiv; loss of function
–> beide Allele des Gens müssen inaktiviert werden damit es zu Krebs kommen kann

42
Q

Warum sind Mutationen in bösartigen Tumorzellen vermehrter?

Nennen Sie zwei Bsp.

A
  • keine Apoptose wird in den Zellen eingeleitet wird
  • vermerhter Zellzyklus, vermehrte Signalweiterleitung
    Tumor entsteht durch sie wiederholenden Zyklen von Proliferation und Mutationen

Bsp.: p53, RAS, RAF

43
Q

Welche Ereignisse führen zu einer Konzentrationszunahme des p53-Proteins (vier) und welche Konsequenzen hat das in der Zelle?

A
  • hyperproliferative Signale
  • Hypoxie
  • DNA Schädigung
  • Telomerverkürzung

Konsequenzen:

  • Zelle stellt Zellzyklus ein
  • Apoptose
  • replikative Zellatterierung
44
Q

Was versteht man unter Ataxia teleangiectasia? Welche Symptome treten auf?

A

Louis-Bar Syndrom:

vererbte Systemerkrankung (Chromosomenbruchsyndromen)

Symptome:

  • Gang- und Standunsicherheit
  • Substanzschwund des Kleinhirns
  • Störung der Augenbewegungen
  • psychischer Entwicklungsrückstand
45
Q

Welches Sequenzierverfahren kommt im Prinzip ohne Synthese aus?
Beschreiben Sie das Verfahren und erläutern Sie zwei Vorteile im Vergleich zu anderen Verfahren.

A

Nanopore:

Vorteile
- echtzeit Sequenzierung und niedrige Fehlerrate, da PCR nicht notwendig ist

46
Q

Welche prinzipiellen Unterschiede in Bezug auf die Mechanismen der Floureszenzdetektion bestehen zw. dem Verfahren der Firma Pacific und dem vo Illumina?
Welche Gemeinsamkeiten besitzen sie?

A

Unterschied:
Pacific läuft in Echtzeit und Illumina nur Base für Base

Gemeinsamkeit:

Pacific –>

  • 4 floureszenzmarker Nucleotide, welche klare Emissionsspektren ausbilden
  • dNTPs besitzen je individulle Flouphrore, welche an jeder Phosphatgruppe gebunden sind

Illumina –>
- auch markierte dNTPs die durch Laser angeregt werden

47
Q

Warum kommt es bei Illumina zur Clusterbildung und warum muss das Cluster eine gewisse dichte haben ohne diese zu überschreiten?
Wie kann man eine best. Clusterdichte erreichen?

A
  • Cluster entstehen durch die Brückenamplifizierung (Sequenzierung, Synthese..) wiederholt werden
  • Cluster haben nur forward Einzelstränge
  • das Cluster darf nicht zu dicht sein, da sonst keine Unterschiede erkennbar sind
  • über die Konzentration der Probe kann die Dichte bestimmt werden
48
Q

Welche Sequenzieverfahren sind für Homopolymeren besser geeignet und welche weniger?

A

Illumina und Sanger:
besser geeignet durch die Messung von einzelnen Signalen

Ion Torrent Pyrosequencing:
weniger gut geeignet, da hier nur die Signallösung gemessen wird und das verstärkt sich bei Homopolymeren

49
Q

Erläutern Sie drei unterschiedliche Methoden zur gezielten Lokalisation der Zellen auf einem Chip.

A
  1. Induktion chem. Signale auf Zellchip
  2. Einfluss der Elastizität auf der Oberfläche (harte Flächen werden bevorzugt)
  3. topographische Signalgebung
    mehr Interaktion mit strukturellen Oberflächen im
    Vergleich zu planaren
50
Q

Weche Vor- und Nachteile, sowie Anwendungsmöglichkeiten sehen Sie bei der Bindung von proteinen an Chip - Oberflächen mittels Aptameren.

A

Vorteile:
gute Bindung, hoch spezifisch, chem. Stabilität, bewusste Protein-Protein Interaktionen

Nachteile:
zu groß um in Zellen aufgenommen zu werden,
werden meistens als RNA-Oligonukleotiden aufgebaut und sind dadruch eher vom Abbaubetroffen als DNA

Anwendungsm.:

  • Ansatz in der Tumortherapie
  • Lebensmittelanalytik
51
Q

Zystische Fibrose wird autosomol rezessiv vererbt.

Beschreiben Sie allg. Charakteristika dieses Erbgangs.

A
  • homozygot
  • Eltern sind Konduktoren
  • merkmalsfreie Generationen werden übersprungen
  • geschlechlechtsunabhängig
52
Q

Welcher Mechanismus liegt der zystischen Fibrose zugrunde?

A
  • Fehlfunktion der Chloridkanäle verändern Sekrete exokiner Drüsen

in den Kanälen werden Cl- Ionen aus der Zelle tranportiert und anschließend über Osmose kommt H2O aus der Zelle in umliegendes Gewebe

Bei Defekt:
Wassergehalt der Sekrete zu niedrig -> Funktionsstörungen der vers. Organe

53
Q

Beschreiben Sie drei Möglichkeiten Aptamere zu stabilisieren und begründen Sie diese Notwendigkeit.

A
  1. Einbau chemisch modifizierter nukleaseresitenter Nukleotide
  2. Nachträglicher einbau modifizierter Nucleotide an Stelle unmodifizierter
  3. LNAs = lockd Nuclec Acids
  4. Spiegelmer, also Enantiomere
  5. Einführung von F-Gruppen in die Nucleinsäure
  6. Einführung intramolekularen Etherbrücken über Position 2’

Notwendig:
RNA Aptamere sind unstabil und werden schneller abgebaut

54
Q

Welche Vor- und Nachteile bietet die Spiegelmer-Technologie bei Aptameren?

A

Vorteil:
Spiegelbilder von Oligonukleotiden können von Nuleasen nicht erkannt werden -> mehr Stabilität

Nachteil:
Spiegelmer braucht das Enantiomer vom Zielmolekül

55
Q

Was versteht man unter Affibodies und wie sind die aufgebaut?
Geben Sie eine mögliche Anwendung an

A

Non-Immunglobulin based Affinitäts Regeneration
- Peptide die man aus Bakterien entnehmen kann
(staphylococcus aureus Prot. A)
- Aufbau: 3 alpha-Helices, keine Difulfide, 6 kDa
- können an Thrombin binden

56
Q

Nennen SIe alternativ/ergänzende Methosen zur Karyotypisierung und Endeckung genomischer Erkrankungen + die Voraussetzungen / Vorteile

A
  • FISH, Sequenzierung
  • genom. Erkrankungen = Erkrankungen die weiter vererbt wurden und das Genom betreffen

z. B. Sequenzierung bei Trisonomie 21
- mütterl. Blut entnehmen und aufarbeiten über Sequenzierung
- ist nicht 100% sicher
- über 2% embryonale DNA nötig

57
Q

Beschreiben Sie eine Möglichkeit zur Bindung eines Proteins über weitere peptische Struktur

A

Homopolymer =
Makromoleküle aus Grundstein gleicher Art

Interaktions-Array:

  • Sondenpeptide auf der Oberfläche reagieren mit Zielprotein
  • Identifizierung von Protein Interaktionen
58
Q

Wann kommt es zur Zunahme von p53?

A
  • Hyperproliferative Signale, bei DNA Schädigungen und bei Hypoxie
  • Einstellung des Zellzyklus und Apoptose
59
Q

Was für eine Funktion hat ein Massenspektrometer und welche Info kann man beim Ionisationsverfahren entnehmen?

A

Funktion:
Herauszufinden wie die Gesamtsequenz und Reihenfolge (Aufbau) eines Proteins ist

Methoden:
entweder die Moleküle werden so sehr ioisiert, dass sie nicht fragmentieren oder dass die fragmentieren um Struktur und MAsse zu erhalten

Bsp.: ESI-Ion Trap oder MALDI-Tof

60
Q

Welche Sequenzierungsverfahren sind am schnellsten?

A

Pacific Biosciense und Ion Torrent

61
Q

Erklären Sie stichwortartig, welche routinemäßige Erweiterung von Sequenzierungsanalysen in der PID ist in der Zukunft zu erwarten?
Bennenen Sie Erkrankungen und Symptome.

A
  • frühzeitige Trisomomie 21 Erkennung
  • Blut der Mutter entnehmen -> DNA sequenzieren ->
    schauen welche Sequenzen in welcher Menge auf welchem Chromosom zugeordnet werden können ->Vergleich mit dem Standard

Symptome: geistl. Rekradierung und Nackenfalte

62
Q

Was sind Sequenzierungsverfahren durch Synthese?

A

Sanger, Pyroseq., Illumina, Iron Torrent und Pacific

63
Q

Die Sequenzierungsverfahren der Firmen Illumina und Pacific Bioscience haben folgende Merkmale..

A

Pacific:

  • Synthese über Sequenzierung
  • in Echtzeit

Illumina:

  • Cluster
  • Cluster darf nicht zu hoch sein
  • passende Clusterdichte durch Konz. der Fragmente
64
Q

Der Bindungsmodus enes Aptamers unterscheidet sich prizipiell von dem eines AK. Durch welche Aptamerstruckturen könnte man eine analoge Bindung (wie AK) erreichen?

A
  • Aptamere haben eine und AK haben zwei Bindungsstellen

- durch einen Spacer kann man zwei Aptamere verbinden

65
Q

Was verstehen Sie unter epigenetischen Veränderungen?

+ Bsp.

A

Methylierungs- /Acetylierungsveränderungen

  • Prader-Will Syndrom
66
Q

Beschreiben Sie den Aufbau und die Funktion eines enzymatischen Proteinchips (Chip zur Messung enzymatischer Aktivität) anhand eines selbst gewählten Bsp.

A

Aufbau:
Oberfläche, GLass, Silikon

Immobilisierung:
Zufällig (covalent über Amine, Adsorption) einheitliche Immobilisierung- Affinity Tag.

Proteine werden auf Glasträger aufgebracht und immobilisiert. Die Peptide werden dafür so zusammengesetzt, dass sie die Oberfläche des gesuchten Krankheitserregers nachbilden -> Blut des Patienten -> Infektion zeigt sich durch die vielen AK im Blut -> binden an die Oberfläche

67
Q

Beschreiben Sie drei prinzipiell unters. Typen an Sonden zur Bildung von Zielproteinen an einen Proteinchip.

A

Antibodies:
150 kDa, Standard

Affibodies:
künstliche, vom Protein A aus dem Bakterium Staphyloc. abgeleitete Peptide, die zur Bindung von Antigenen befähigt sind

Aptamere:
sind urze einzelstr. DNA-/RNA-Oligonukleotide (25-70 Basen), die ein spez. Molekül über ihre 3D.Sturkut binden können.

68
Q

Was sind Microarrays und welche Vorteile haben sie?

A
  • Biosensoren (eine in Lösung und die andere immobilisiert auf der Oberfläche)
  • Miniaturisierung (Kostenreduktion)
  • parallele Reaktionen (Zeitersparnis)
  • Markierungen (z.B. Floureszenzfarbstoffe) mit hoher Sensibilität
69
Q

Wo kann ein DNA-Microchip sinnvoll eingesetzt werden?

A
  • Mutation des genetischen Erbguts und hierdurch resultierende Erbkrankheiten
  • Genexpression und veränderte Genexpressionen
  • Wirkung von Medis auf Genexpression
    Identität von Lebewesen
70
Q

Was ist das SELEX-Verfahren? Beschreiben Sie den Ablauf.

A

= Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment

  • kombinatorisches Verfahren zu gerichteten Evolution von Oligonukleotid-Strängen z.B. ssDNA/RNA
  • können als Liganden spezifisch an ausgewählte Targets binden
  1. Nach chemischer Synthese eines Ausgangspools einzelsträngiger DNA, wird dieser durch präperative PCR vervielfältigt
  2. Übersetzung der DNA in RNA mitels T7 Transkription
  3. Vorliegen eines RNA- Startpools für 1. SELEX Runde
  4. Startpool in Bindungspuffer gelöst und über eine ausschließlich Trägermaterial enthaltende Vorsäule geschickt
  5. Sequenzen die eine hohe Affinität zum Säulenmaterial aufweisen, von Nukleinsäurepool abgetrennt
  6. Anschließend 1. Affinitätselution
  7. RNA`s auf Hauptsäule gegeben, an der die Targetsubstanz direkt oder über Spacermolekül immobilisiert ist
  8. Nichtbindende Ribonukleinsäuren werden bei Affinitätselution von bindenden RNA Molekülen getrennt
  9. Selektierten Sequenzen durch reverse Transkription in cDNA umgeschrieben
  10. cDNA mittels PCR vervielfältigt
  11. erneute T7 Transkription
  12. Vorliegen eines angereicherten RNA Pools mit bindenden Sequenzen -> Ausgangspool für folgende SELEX Runde 13. Nach erfolgreicher Selektion( 8-15 Runden) wird der durch PCR erhaltende cDNA Pool kloniert, sequenziert und charakterisiert -> Selektion bindender RNA Moleküle, Abtrennung nicht bindender Sequenzen (Seperation), enzymatische Vervielfältigung und Mutation
71
Q

Erläutern Sie Vor- und Nachteile von:

Bindung eines Aminoglykosidantibiotikums

A

Vorteil:
Affibody erkennt Erreger, Antibiotikum bekämpft den Erreger direkt. Geringere Nebenwirkung durch die gezielte Wirkung am Erreger

Nachteil:
teuer, langwierige Herstellung

72
Q

Erläutern Sie Vor- und Nachteile von:

Bei Bindung von Thromben

A

Vorteil:
Markierung der Thromben und eventuell Beseitigung der Thromben durch Medis.

Nachteil:
teuer, langwierige Herstellung, Thromben werden immer größer.

73
Q

Welche Aussage zu den Clustern ist richtig:

  • Beim Illumina typischen Amplifikationsverfahren kommt es zur Ausbildung von Clustern
  • Die Clusterdichte darf zu hoch sein aber nicht zu niedrig. weder zu hoch noch zu niedrig
  • Eine höhere Clusterdichte lässt sich durch kleinere Fragmente (z.B. des zu sequenzierenden Gens) erreichen
  • Eine passende Clusterdichte lässt sich durch die Konzentration der zu amplifizierenden Fragmente (Bridge Amplification) einstellen.
A
  • Beim Illumina typischen Amplifikationsverfahren kommt es zur Ausbildung von Clustern
  • Eine passende Clusterdichte lässt sich durch die Konzentration der zu amplifizierenden Fragmente (Bridge Amplification) einstellen.
74
Q

Wie unterscheiden sich Gefäße von Tumor von normalen Gefäßen?

A

Tumor:

  • wachsen unorganisiert und stark gewunden
  • Haben eine Wandstruktur, welche an Kapillaren erinnert o. besitzen eine inkomplette Basalmembran, dadurch sind die Gefäße nicht druckstabil (-> Leaking).
  • besteht hauptsächlich aus Endothelzellen, keine Perizyten.
75
Q

Wozu dient die Protein-Analytik?

A
  • um alle Proteine zu katalogisieren
  • Funktion zu verstehen
  • Interagtion unterienander
  • Methode, die in der Lage ist, die Gesamheit aller Proteine zu charakterisieren, welche zu einem Zeitpunkt hergestellt werden: Proteomics
76
Q

Wie kommen Proteine auf einen Chip?

A
  • Probe aus Zellen oder Gewebe extrahieren -> markieren mit Fluoreszenzfarbstoffen, photochemisch oder über Radioisotop

Das Protein-Microarray enthält ebenso wie ein DNA-Microarray eine Vielzahl von Testfeldern auf engstem Raum. Allerdings werden beim Protein-Microarray in jedem Testfeld - auch Spot genannt - kleine Protein-Mengen auf dem Trägermaterial fixiert.

Der spotten genannte Vorgang erfordert wegen der kleinen Testflächen mit geringem Abstand eine hohe Präzision und wird daher von speziellen Geräten durchgeführt.

77
Q

Welche Vor- und Nachteile besitzt die Massenspektrometrie?

A

Vorteile:

  • keine Markierung nötig
  • schnelles Auftrennen
  • hohe Sensivität

Nachteile:

  • Sensivität ist dennoch geringer als bei Arrays
  • Genauigkeit geringer
  • erhöhte Probenreinheit erforderlich