Module 4.2 : L'épissage de l'ARN [Part 2]

Question 1

Il y a 3 classes de splicing ARN, quelles sont-ils et sur laquelle on ce concentre dans le cours?

Answer 1

1. Nuclear Pre-mRNA
2. Group I introns
3. Group II introns

Ce que nous intéresse est l’épissage des ARNm, c’est celui le présent chez les eucaryotes!
* Les introns des groupes I et II sont enlevés par auto-épissage

Question 2

Machinerie de l’épissage de l’ARNm

Answer 2

Splieceosomes major and minor

Question 3

La différence entre spliceosome mineur et major?

Answer 3

Quelques mRNA sont épissées par le mineur et il y a quelques différences avec le majeur, même si c’est la même chimie :
1. De nouveau Snurps, sauf U5
2. Site d’épissage différent, même branch site tho : GU-AG → AU-AC

Question 4

Qu’est-ce que le trans-épissage?

Answer 4

L’épissage trans est une variante du mécanisme d’épissage classique, appelé épissage cis.
Dans celui, on combine au moins deux transcrits venant d’un gène différent.

Ex : Le trans-épissage a été observé chez divers organismes, y compris les plantes, les protozoaires et certains animaux. Chez les trypanosomes, par exemple, le trans-épissage est essentiel pour la maturation de l’ARNm et la production de protéines. Il est également impliqué dans la régulation de l’expression génétique, la diversification des protéines et l’évolution des génomes.

Question 5

3 différences du trans-épissage ?

Answer 5

1. Exons provenant de plus de 1 transcrits!
2. Différence dans le spliceosome (surtout U1)
3. Le lariat n’est pas en lassot, mais en Y.

Question 6

La voie d’épissage des introns du groupe II seraient liés au niveau évolutif au spliceosome, explique.

Answer 6

En effet, les introns du group II forment deux domaines 5 et 6 qui sont similaires au U2-U6 (complexe C du spliceosome)
→ Hypothèse : mécanisme post-évolution, avant que l’ARNm se complexifie.

Question 7

Différence entre Les introns du groupe I et du groupe II et ARNm? (2)

Answer 7

1. Plus petite séquence de nucléotide (400-1000)
2. Comme une grande partie de l’intron est essentiel pour l’épissage (remplace spliceosome), cela nécessite une structure précise.

Question 8

Pour le groupe II : Évènements chimiques similaires à l’épissage
par le spliceosome, SAUF :

Answer 8

• Pas de protéines
• Pas d’ATP

Question 9

Quelles sont les 2 structures importantes de la voie d’épissage du groupe I?

Answer 9

• Une séquence guide interne (IGS) est présente dans les introns du
  groupe I pour identifier le site 5’ d’épissage
• reconnait une séquence dans l’EXON (Site de liaison / branchement de G)

Question 10

Qu’est-ce qu’une ribozyme

Answer 10

Un ARN capable de catalyser une réaction chimique (Une enzyme RNA!)

Question 11

L’épissage des introns du groupe I étape par étape

Answer 11

1. Formation de la structure en tige-boucle : L’intron du groupe I forme une structure tridimensionnelle complexe, composée de plusieurs tiges-boucles et hélices, appelée ribozyme. Cette structure confère à l’intron la capacité d’agir comme une enzyme et de catalyser sa propre excision.
2. Une guanosine libre s’associe au site de liaison G, celle-ci est responsable de la première trans-estérification en attaquant le 5’ de l’intron.
3. Cela libère le 3’ OH of exon 1 which gonna attack 5’ phosphate of exon 2.
   → deuxième trans-estérification, par la suite les deux exons se rejoignent, et l’objectif est atteint.
4. Cyclisation : 1) IGS base pair near 5’ end of the excise intron
   → Cela permet de guider la dernière réaction de trans-estérification.
   2) Le nucléotide G de l’extrémité 3’ vient cliver l’intron, ce qui:
   * Inactive l’activité du ‘ribozyme’
   * Empêche la réaction inverse

Question 12

Quelle est la différence entre in vivo et in vitro pour les introns de group I?

Answer 12

In vivo : des protéines supplémentaires sont nécessaires (masquent charge nég. phosphate)
In vitro : Charge contrôlée par la salinité de la solution

Question 13

Explique ce qu’est la réaction de trans-estérification?

Answer 13

Un groupement OH (hydroxyle) libre, attaque le groupement phosphate d’une guanine, ce qui entraine le bris d’un lien phosphodiester qui sera remplacé par un même lien phosphodiester.

Question 14

2 causes d’erreurs d’épissage

Answer 14

• Les sites de reconnaissance sont très courts et relativement peu conservées
• Introns très grands (jusqu’à 800 000 pb) comparativement aux exons (150 pb)

*ils semblent alors très facile pour les snurps de faire une erreur!

Question 15

2 exemples d’erreurs d’épissage

Answer 15

1. Non-reconnaissance d’un site d’épissage 3’
   * Excision non souhaitée d’un exon complet
2. Reconnaissance d’une séquence ne correspondant pas à un site d’épissage
   * Coupure à un « pseudo » site

Question 16

Mécanismes assurant la fidélité de l’épissage (2)

Answer 16

1. La reconnaissance des sites d’épissages est un mécanisme co-transcriptionnel : Facteur attaché à la queue CTD de la polymérase, vont s’attacher à l’ARN à la fin de la transcription (élongation) et vont reconnaître les sites 5’ et 3’ d’épissage
2. Définition des exons :
   Des séquences présentes dans les exons (ESE; exonic sequence enhancers;
   amplificateur exonique) sont reconnues par des protéines riches en sérine et
   arginine (protéines SR).
   * Les SR recrutent spécifiquement U2AF (3’ de l’intron) et U1 (côté 5’)
   * S’assurent que les sites utilisés sont les bons (i.e. localisés près des exons!)

Question 17

Rôle supplémentaire des protéines SR dans la précision de l’épissage

Answer 17

Grande variété de protéines SR :
* Précision et efficacité de l’épissage constitutif (définition d’exon)
* Régulation de l’épissage alternatif

Question 18

Combien de % des maladies génétiques sont reliées à une mutation dans les sites de reconnaissance de l’épissage ou
dans la machinerie d’épissage? Et nomme ces maladies

Answer 18

≈ 15% des maladies génétiques humaines.
* β-thalassémie
* Déficit familial isolé en hormone de croissance de type II
* Rétinite pigmentaire
* Amyotrophie spinale
* Certains cancers
* Certaines maladies auto-immunes (arthrite et lupus)

Question 19

Épissage constitutif vs épissage alternatif.

Answer 19

Alternatif : pas tous les exons sont gardés (erreur volontaire!!)
→ part entière de la régulation de l’expression du génome!

Question 20

Comment appel t’ont les nouveaux gènes ou variant d’ARN mature créé par l’épissage alternatif?

Answer 20

Isoformes

Question 21

Donne les chiffres moyens d’épissage alternatif, humain vs levure

Answer 21

Levure : peu d’épissage (5%) et donc très peu d’épissage alternatif.
Humain : ≈ 90 % des gènes subissent un épissage alternatif, en moyenne un ARNm (gène) à 2-3 isoformes.

Question 22

Quelles sont les cas extrêmes d’épissage alternatif? (humain, drosophile)

Answer 22

Humain : le gène humain Slo :
* 500 ARNm différents par l’épissage alternatif d’un seul gène!
Drosophile : Dscam est transcrit et épissés en 38 000 isoformes!

Question 23

L’épissage alternatif : différentes façons d’épisser un pré-ARNm

Answer 23

Étudier la figure p.29

Question 24

Quelles sont les 2 modes d’épissages alternatifs de la troponine?

Answer 24

1. Saut d’exon (le plus fréquent)
2. Exclusion mutuelle (10%) : Alternance entre exons exclus, la présence de l’un exclut l’autre.
   → Cassette d’exons

Question 25

3 mécanismes d’épissage mutuellement exclusif

Answer 25

1. Encombrement stérique : U1 et U2 se bloque l’un et l’autre (physiquement)
2. Utilisation des spliceosomes majeurs et mineurs
   à préciser avec la prof
3. Système NMD (2 codons stop): Parfois certaines combinaisons d’exons résultent d’un bris dans la symétrie (multiple de 3). Cela créer un codon stop prématuré qui sera reconnu par NMD.
   → Elle la dégrade rapidement ce qui empêche la création de protéine dénaturée!

Question 26

Les trois codons stop

Answer 26

-UAG
-UGA
-UAA

Question 27

Qui est derrière la régulation des différents mécanismes d’épissage alternatif?

Answer 27

1. protéines de la famille SR (serine/arginine-rich)
2. les protéines hnRNP (hétérogènes nucléaires ribonucléoprotéines).

Les protéines SR sont généralement des activateurs d’épissage, tandis que les protéines hnRNP peuvent agir comme activateurs ou répresseurs d’épissage, selon le contexte.

Question 28

Donne un exemple de comment un activateur fonctionnent. [alternatif]

Answer 28

Quand l’activateur (protéine SR) n’est pas présent, le spliceosome reconnait le site, mais ne l’épisse pas.

→ Il peut donc avoir un saut d’exons par exemple pp.39

Question 29

Donne un exemple supplémentaire qu’une protéine Sr peut favoriser (activateur)

Answer 29

Gène codant l’antigène T du virus SV40 :
Favorise un site 5’ plus en amont, ce qui résulte d’un mRNA plus long, mais possédant un codon stop
→ Forme t-ag (raccourci) est favorisé pp.40

Question 30

Comment fonctionne le répresseur Hrp36 dans l’épissage de Dscam?

Answer 30

Splicing et repressor site sont les mêmes, la présence d’un repressor bloque physiquement l’accès au spliceosome!

Question 31

Qu’est-ce qu’un exon cassette ?

Answer 31

Quand il y existe au moins 2 alternatives pour le même gènes.

Question 32

Comment fonctionne l’étrange cas du gène Dscam de la drosophile?

Answer 32

La séquence d’ancrage est une séquence conservée située à proximité de chaque cassette d’exon. Elle sert de site de liaison pour les protéines impliquées dans le processus d’épissage. Les séquences de sélection, quant à elles, sont des séquences spécifiques à chaque exon alternatif, qui interagissent avec la séquence d’ancrage pour guider l’incorporation d’un exon spécifique dans l’ARN mature.

-> De cette manière, un exon par cassette est choisi grâce à ces deux structures!

EN GROS : On ancre la cassette et on sélectionne l’exon voulu.

Question 33

Explique comment l’épissage peut être régulé par la compétition.

Answer 33

Dans le cas du gène Tat (VIH), il peut y avoir compétition entre 2 activateurs et 1 répresseur.

Question 34

Donne un exemple de régulation de l’épissage : Le sexe de la drosophile. (3 gènes en jeu)

Answer 34

1. Le gène Sxl qui régule le prochain gène de la cascade, mais pas que puisqu’il s’autorégule.

→ Dans le cas des femmes (2 X contre 1 pour les hommes), Sxl est un répresseur qui bloque un site d’épissage trad. Entraine un saut d’exon qui permet par la suite la traduction du gène fonctionnel.

2. Gène Tra régule le dernier gène de la cascade.

-> Pour les hommes, l’absence d’un gène sxl fonctionnel créer une extension d’exons rendant les gènes Tra à leur tour non fonctionnel.

3. Gène Dsx : dans cet exemple, il est en deux isoformes mutuellement exclusif.

→ Pour les femmes, les protéine Tra fonctionnel qui ont été produits précédemment sont en fait des activateurs! Ils vont favoriser l’épissage de l’exon (1-2) ce qui entraîne le développement féminin.

** On parle d’un mécanisme d’exclusion mutuelle, car l’épissage par défaut est celui (1-3) qui résulte du développement masculin. Et surtout que l’un empêche l’autre d’exister.

Question 35

Quelle est la différence entre la régulation du gène Dsx et les 2 autres de la cascade?

Answer 35

Régulateur de trancription

Question 36

Nous savons que le premier gène de la cascade déterminant le sexe de la drosophile est le gène Sxl. Explique ce qui se passe au niveau de la régulation de l’épissage avant même que la cascade s’amorce.

Answer 36

Les activateurs de transcription sis-a et sis-b, comme ils proviennent du chromosome X, ils sont deux fois plus nombreux pour les femmes.

→ Résulte d’un ratio 1 répresseur/ 1 activateur pour les hommes, le répresseur l’emporte, empêchant ainsi la transcription du gène Sxl.

Question 37

Nous savons que le docking site localisé avant une cassette d’exon de la drosophile à la spécialité de pouvoir s’attacher à n’importe laquelle des isoformes via leur selector sequence associé. Alors comment fait-elle pour en sélectionner une seule?

Answer 37

L’action de répresseur qui bloque tous les selector sequences à l’exception d’une.

Question 38

Il y a un deuxième mécanisme similaire au système NMD, mais lors de la traduction cette fois-si.

Answer 38

Le ribosome s’arrête sur un codon STOP prématuré, Le codon jonction (EJC) qui était censé se détacher reste en place.

→ Va faire décrocher le ribosome de l’ARN + recrute enzyme qui vont dégrader la coiffe et la queue poly-A de l’ARN défectueux menant à sa destruction.