Microscopia a fluorescenza Flashcards
Che tipi di filtri ci sono?
- Long pass: fa passare la luce sopra una λ di cut-off.
Esempio: LP500 → passa la luce sopra i 500nm - Short pass: fanno passare la luce al di sotto di una λ di cut-off
Esempio: SP500 → passa la luce sotto i 500nm - Band pass: fanno passare una banda
Esempio: BP500/20 → 500nm è la λ al centro della banda, qua passa da 490 a 510 - Dichroic filter: si comportano da specchio o da filtro a seconda della λ.
A seconda della loro inclinazione riflettono la luce fino a una cera λ e sono attraversati a λ maggiori.
Quali possono essere le sorgenti?
Le lampade al tungsteno fanno principalmente luce nell’infrarosso (scaldano molto, è necessario un sistema di ventole), tutta questa energia è sprecata. Nella regione del visibile l’emissione non è uniforme.
Costano poco e sono facili da sostituire, durano da 30 a 50 ore quando al massimo del voltaggio. Di solito però si usano al 2-4% quindi durano centinaia di ore.
HBO: high pressure mercury vapor arc-discharge lamp. Ha circa 1/3 della sua potenza radiante che cade nel visibile, il resto è nell’UV, nell’infrarosso non c’è quasi niente. Il profilo è migliore rispetto a quelle al tungsteno.
Metal halides: alogenuri metallici. Hanno un profilo simile all’HBO ma con maggiore intensità di emissione nel visibile.
Arc lamp: lampada ad arco di xeno. È la stella lampada usata in un fluorimetro ma con potenza diversa. Ha:
- 20% della sua emissione nel visibile però è molto uniforme.
- 70% nell’infrarosso (sopra i 700nm)
- 5% nell’UV
LED: light emitting diode. Hanno un’emissione lungo una sola lunghezza d’onda con una certa larghezza di banda (non coprono tutto lo spettro).
Variando la composizione copriamo tutto l’UV-Vis.
Svantaggi: se voglio usare fluorofori diversi devo usare led diversi.
Vantaggi: ha tutta l’illuminazione concentrata in una regione spettrale, non spreco energia e aumento l’efficienza. La durata è superiore a 10’000 ore senza perdita di intensità di emissione.
Laser: Vantaggi:
- Altamente monocromatico
- Ad altissima intensità
- Altissima stabilità sia a livello spaziale che temporale
- Si possono focalizzare in un punto del campione
Svantaggi: costano più dei led.
Come funziona la tecnica widefield?
Quando illumino il campione la luce eccitatrice va sullo specchio dicroico e viene focalizzata sul campione. La luce di emissione raccolta arriva dal punto focale da parte dell’intera zona tridimensionale del campione colpita e colpisce il detector.
La fluorescenza, quindi, è emessa da tutto il cono di campione eccitato, al detector arrivano quindi più raggi emessi, non tutti completamente a fuoco.
Come funziona la microscopia confocale?
Eccito tutta la zona del campione ma inserisco una fenditura prima del detector, in questo modo solo la luce emessa dal punto in cui io sono a fuoco arriva al detector.
Nonostante io abbia eccitato tutto il volume del campione, al detector arriva solo la fluorescenza del piano focale.
Posso cambiare il piano focale muovendomi sull’asse x o y però devo poi muovere di conseguenza anche la fenditura. Se invece di avere solo un pinhole ne abbiamo un array (tanti) possiamo fare più scansioni senza muovere ogni volta. Questo mi permette di fare un sezionamento ottico e fare una ricostruzione tridimensionale senza dover preparare fettine di campione. In questo modo posso analizzare un campione, ad esempio cellulare, e poi farlo crescere ancora e ri-visualizzarlo successivamente.
Facendo così raccolgo però poco segnale dal campione quindi mi serve una sorgente molto potente (laser) per poter raccogliere abbastanza segnale.
Come funziona la microscopia a due fotoni?
Con una normale eccitazione (1 fotone) viene mandato un fotone con una λ corrispondente alla ΔE (stato rilassato e stato eccitato).
I 2 fotoni vanno mandati in rapida successione, ognuno con una λ tale che il pacchetto di energia (ΔE) è metà di quello che si manderebbe con un solo fotone. Si genera uno stato virtuale in cui la molecola ha assorbito un po’ di energia (non abbastanza per eccitarsi) e con l’assorbimento del secondo fotone si arriva allo stato eccitato.
Vantaggi:
- Più le λ sono nel near IR, più possono penetrare nel campione
- La risoluzione è migliore: la somma dei due fotoni è efficace solo nel punto in cui il laser è indirizzato (eccito solo a fuoco e detecto solo a fuoco).
Su cosa si basa la microscopia a fluorescenza super-risolta?
Legge di Bragg: rispetto alla lunghezza d’onda ottengo risoluzioni diverse
Interferenza costruttiva o distruttiva dei fasci emessi
Che cos’è la STED?
Stimulated emission depletion. È una microscopia a scansione: il sistema si sposta sul campione e fa eccitazione/spegnimento su tutta la zona del campione.
Combina l’eccitazione permessa dal laser con l’utilizzo di un altro laser (laser STED) concentrico al precedente che fa dis-eccitare immediatamente la zona eccitata.
Se con il primo laser eccito una zona e poi con lo STED dis-eccito la stessa zona tranne una piccolissima zona centrale (uso una maschera per bloccare una piccola porzione del laser STED): ho così la possibilità di vedere un pezzo molto più piccolo rispetto alle tecniche precedenti.
Quali sono i problemi nell’ottenere immagini in vivo 3D?
- Danno causato dall’eccitazione
- Processi molto dinamici
- Dimensione del campione
- Posizionamento del campione
- Fluorescenza fuori fuoco
Se si fa una scansione lenta, gli oggetti in movimento risultano fuori fuoco, se invece si fa una scansione veloce si perde risoluzione
Che cos’è la lightsheet fluorescence microscopy?
uso una via di eccitazione laterale (light sheet) sotto forma di lamina di luce da entrambi i lati del campione: questo permette di eccitare solo il piano focale e quindi si raccolgono le informazioni di emissione solo da parte della zona che ho illuminato.
Si ha un percorso ortogonale tra la direzione della lamina del foglietto di luce e la direzione del detector della fluorescente.
Vantaggi:
- Si illumina in modo uniforme tutto il campo da cui viene raccolta la luce: si illumina sia da destra che da sinistra così il campione è sicuramente illuminato interamente
- Se ho un foto-danneggiamento è limitato all’area che sto indagando
Come posso posizionare il campione per una lightsheet fluorescence microscopy?
- Camere per lasciare il campione in ambiente acquoso: l’animale non deve essere in grado di ruotarsi autonomamente quindi sono molto piccole. Grazie all’ambiente acquoso controllo temperatura, umidità…
- Camere con hydrogel
Il campione deve poter essere mosso per esaminare sezioni diverse per ricostruire un’immagine 3D. Si può sia ruotare che muovere perpendicolarmente/parallelamente.
Quali meccanismi possono portare alla fosforescenza?
Serve il passaggio allo stato di tripletto e può avvenire mediante:
- Intersystem crossing da S1 a T1: viene assorbita luce, le molecole si accumulano al livello vibrazionale più basso del 1° stato eccitato di singoletto (al di sotto del livello vibrazionale più basso dello stato di singoletto S1). Si ha quindi il trasferimento della molecola da un livello vibrazionale dello stato S1 ad un livello vibrazionale di T1.
La molecola, giunta nello stato T, perde poi il suo eccesso di energia vibrazionale e si colloca nello stato vibrazionale più basso di T1. - Transizione diretta S0→T1.
Cosa sono ed esempi di fluorofori
È un numero grandissimo di molecole con diverse varianti strutturali, principalmente emettono nel visibile e sono organici.
Esempi: quantum dots e sistemi con ioni lantanidi
Che cosa sono i quantum dots?
Sono semiconduttori (inorganici) con spettro di assorbimento largo e un’emissione molto stretta.
La dimensione della nanoparticella (da 6 a 2nm) definisce il band-gap (ΔE tra banda di valenza e di conduzione): minore è la dimensione, maggiore sarà il ΔE e quindi la lunghezza d’onda.
Spesso sono composti da materiali tossici quindi ora non si applicano nell’ambito clinico.
Hanno una brillantezza maggiore rispetto ai fluorofori organici.
Quali sono le caratteristiche degli ioni lantanidi?
- proprietà di emissione che derivano dalla loro complessa struttura elettronica che coinvolge orbitali di tipo f. coprono diverse lunghezze d’onda nel visibile, nell’UV e nel near IR.
- Hanno uno stokes shift molto ampio: eccitati nell’UV e emettono in Vis o NIR. Attualmente la finestra di imaging utilizzata è chiamata NIR1 (700-900nm): al di sotto di questa finestra abbiamo un forte assorbimento e si ha molto scattering e autofluorescenza.
Si possono usare anche le finestre NIR2 o NIR3: queste sono separate dalla lunghezza di assorbimento dell’acqua nell’infrarosso.
Che cos’è il fenomeno di up-convertion?
due o più fotoni incidenti a bassa energia sono assorbiti e convertiti in un fotone emittente con energia maggiore. Illumino nel NIR e ho emissione nel visibile.
I meccanismi responsabili per questo fenomeno sono diversi:
- ESA: come nel due fotoni
- ETU: energy transfer up-conversion. Un lantanide assorbe l’energia, la trasferisce a quello vicino che passa allo stato eccitato superiore
Perché l’up-convertion funzioni devo avere una matrice che mantenga gli ioni isolati ma abbastanza vicini da trasferirsi energia.
