Methoden

Question 1

qPCR

Answer 1

qPCR, real-time PCR (Echtzeit!)
dient Nchweis und Quantifizierung von Nukleinsäuren (DNA und RNA)
* Farbstoffbasierte qPCR: SYBRgreen bindet spezifisch an dsDNA -> Floureszenzserhöhung, je mehr dsDNA vorhanden (2 sequenzspezifische Primer + Farbstoff)
* Sondenbasiert qPCR: flourophormarkierte, sequenzspezifische Sonde -> Floueszenz wird gemessen (ermöglicht QUantifizierung merherer Targets in einer Reaktion Multiplexing, 1 spezifisches Flourophor pro Target)
Echtzeitmessung da nach jedem Zyklus die Floureszenz gemessen wird.
niedriger Ct Wert, höhere Genexpression -> aber musss standartisiert werden (realtive Quantifizierung)

Question 2

realtive Quantifizierung (qPCRC)

Answer 2

Messung der mRNA-Menge des interessierten Gens im Verhältnis zur Genexpression von Refenzgen
* fungiert als Kontrolle für unterschiedlichliche AUsgangsmegnen bei mehreren Proben
* fungiert als Kontrolle für ungewollte Variation bei Probenbehandlung

Referenzgene (housekeeping genes)
werden in jeder Kernhaltigen Zelle exprimiert &
in grunglegenden zelluläre Prozesse eingebunden

Um Veränderungen in der Expression eines Gens relativ zu einer refernzprobe oder Kontrollgruppe zu bestimmen

Question 3

emPCR

Answer 3

PCR in waterdroplet (darin alle Reagenzien für PCR enthalten)
+ an winizge Kugel gebundene DNA- Fragmente
-> nach emPCR zahlreiche Kopien an Kugel

Vorher: Zufallszerkleinerung der gDNA in ählich große Fragmente + Ligation von Adaptoren => erstellen einer Fragment Library

Question 4

RAD Sequencing

Answer 4

gDNA der Library wird mit Restriktionsenzym verdaut (Schnittstellen über ganzes Genom verteilt)

“reduced representative library” die nur Genome Regionen enthält, die benachbart zur Schnittstelle liegen -> anschließende Sequenzierung
Aber: große Read unterschieder zw. Individuen, Sequenzvergleich erschwert)

deswegen ddRAD

Question 5

ddRAD

Answer 5

Doppelter Verdau mit zwei Restriktionenzymen (eins schneidet öfter, das andere selten)
Fragmentgrößenselektion -> sehr kleine und sehr große Fragmente entfernt

=> Bibliothek mit Fragmenten bestimmter länge

Question 6

Hybrid Capture

Answer 6

Capture Baits (biotinylierte DNA Fragmente, interesseirter Bereich aus verwandter Spezies)
gDNA, fragmentiert und Adapter ligation
* -> Hybridisierung zwischen Baits und Fragmenten der Sequenzlibrary
* Zugabe von mit Streptavidin beschichteten Partiklen
* KOvalente Bindung von Biotin und Streptavidin
* Magnetfeld zeiht paramagnetische Beads an gefäßwand (rest wird abpepetieirt)
* “gefangene DNA” kann durch Hitze von Bait gelöst werden
* Amplifizierung und Sequenzierung

auch bei stark kontaminierter DNA anwendbar!

Question 7

RNA seq

Answer 7

1. Messung von Genexpression
Quantifizierung der Sequenz von 1 Gen

2. Genstrucktur/ Annotation
Vergleich DNA-RNA sequenz : Exon-INtron Grenzen

3.Alternatives SPlicing
mRNA Isoformen -> welches Protein wird synthetisiert
Exonvarianten

Question 8

454 Roche

Answer 8

Pyrosequencing
Sequencing by synthesis (Echtzeit)

• Pyrophosphationen werden bei verknüpfung abgespalten -> Lichtblitz
• dNTPs werden nacheinaner hinzugegeben, fragmntierte ssDNA
• PCR-> Produkt an Beads mit zahlreichen Kopien des ragments (emPCR)
• Sequenzierungsrpimer + erste dNTPs
  Überall wo eingebaut wird -> Lichtblitz => Basecalling in Reaktorkammer

AAA dreifach stärkeres Signal als A etc.

Question 9

Optical mapping (BioNano)

Answer 9

HMW gDNA aus Zellen -> DNA einzelmoleküle in Microfluid Gerät plaziert
* Restiktionsenzyme schneiden DNA an spezifischer Position “Nicks”
* Schnittstellen werden mit Floureszenzfarbstoff markiert (DNA bleibt intakt)

Übereinanderlagern der MArkierungen enthält man eine “consensus genomic optical map”