Livret 1 Flashcards
Qu’est-ce que l’histologie ? Où est-elle appliquée ?
C’est une discipline scientifique, étudiant les cellules, tissus et organes d’un point de vue morphologique pour comprendre leur fonctionnement.
Application dans :
- Laboratoire de Recherche (étude de cellules en cultures ou d’organes issus d’animaux de laboratoire)
- Milieu hospitalier
- Ensemble des pratiques (permet la réflexion sur les signes et symptômes, afin de déterminer une pathologie)
Quelles sont les deux méthodes d’observation (hors l’œil nu) ?
- Microscopie photonique
- Microscopie électronique
Définition : résolution
Distance minime entre deux points, à laquelle les points sont perçus comme distincts
> Plus la résolution est élevée, plus la distance minime est faible
Quelles sont les résolutions courantes en microscopie ?
- Microscopie électronique : ~0,2 nm
- Microscopie photonique : ~0,2 µm
Quelles techniques de préparation utiliser pour compenser les propriétés du vivant ?
- Si le vivant se dégrade : fixation
- Si le vivant est mou, on enlève l’eau : déshydratation
- Si le vivant est mou, on le durcit : enrobage
- Si le vivant est épais : coupe
- Si le vivant est incolore : marquage
Quelle propriété du vivant rend le tissu impropre à l’observation ?
Une fois le vivant sorti de l’organisme :
- Mécanismes arrêtent de fonctionner
- Enzymes digèrent les cellules
> Bactéries et champignons deviennent pathologiques
De quelle épaisseur doivent être les échantillons pour les deux méthodes de microscopie ?
- Microscopie électronique : 70 nm
- Microscopie photonique/optique : 5 µm
Quelles sont les étapes générales de préparation de l’échantillon ?
- Fixation chimique
- Déshydratation
- Enrobage
- Coupe
- Marquage
Fixation chimique en MP/MO
> Avec quoi ?
> Comment ?
> Formaldéhyde à 4% (formol)
> Échantillon placé dans une cassette
Fixation chimique en ME
> Avec quoi ?
> Comment ?
> Glutaraldéhyde à 2,5% + tétraoxyde d’osmium
> Échantillon placé dans un tube
Déshydratation en MP/MO
> Comment ?
> Avec quoi ?
> Bains d’éthanol successifs de concentration croissante (70%, 90%, 100%)
> Puis bain dans toluène ou xylène par exemple
Déshydratation en ME
> Comment ?
> Avec quoi ?
> Bains d’éthanol successifs concentration croissante (70%, 90%, 100%)
> Bain dans propylène par exemple
Enrobage en MO/MP
> Avec quoi ?
> Quelles étapes ?
> Dans quoi ?
- Immersion dans paraffine à 63°C
- Échantillon placé dans moule en métal
- Durcissement à froid
- Placement dans une cassette pour l’identification du patient et de l’échantillon
Enrobage en ME
> Avec quoi ?
> Quelles étapes ?
> Dans quoi ?
- Immersion dans résine liquide
- Polymérisation à chaud (50 à 120°C) = durcissement à chaud
- Placement dans un moule en silicone de l’échantillon enrobé de résine
- Identification patient/échantillon grâce au numéro du bloc de résine
Coupe en MO/MP
> Avec quoi ?
> Comment ?
> Microtome 2 à 10µm
> Manivelle fait avancer le bloc de paraffine sur le couteau : la coupe glisse puis est récupérée avant d’être étalée sur une lame de verre
Coupe en ME
> Avec quoi ?
> Comment ?
> Ultra-microtome 60 à 150 nm
> Manivelle fait avancer le bloc de paraffine sur le couteau en éclat de diamant : les coupes flottent dans une cuve puis sont récupérées et étalées sur des grilles métalliques
Marquage en MO/MP (similaire en ME)
> Procédure détaillée
- Déparaffinage
> Retrait de la paraffine qui est imperméable aux produits suspendus dans l’eau - Réhydratation
> Bains d’éthanol successifs, mais de concentration décroissante (100%, 90%, 70%, eau) - Eau
> Procédure de marquage généralement en milieux aqueux
Quelles sont les 4 techniques de marquage en microscopie photonique ?
- Coloration
- Immunomarquage
- Hybridation in situ
- Histoenzymologie
Qu’est-ce que le contraste en ME ? Comment le révéler ?
Imprégnation des échantillons par des sels métaux lourds (acétate d’uranyle, citrate de plomb)
Nécessité d’exposer la coupe à un faisceau d’électrons pour révéler le contraste
Marquage en MEB
> Procédure
Métallisation : échantillon fixé sur un plot métallique dans une chambre de métallisation, puis il est pulvérisé d’atomes, qui forment une couche homogène
À quoi sera exposé l’objet selon le type de microscopie ?
- Microscopie photonique/optique : faisceau de photons (lumière)
- Microscopie électronique : faisceau d’électrons
Composition d’un microscope électronique à transmission (MET) ?
- Source d’électrons (= canon à électrons)
- Lentille objective
- Lentille de projection
Principe de la MET
Utilise un faisceau d’électrons qui traverse l’échantillon et arrive à un écran fluorescent (= un détecteur)
Que permet d’observer la MET ?
Les structures subcellulaires : mitochondrie, noyau, etc (tout ce qui est à l’intérieur de la cellule
Que permet d’observer la MET ?
Les structures subcellulaires : mitochondrie, noyau, tout ce qui est à l’intérieur de la cellule
Comment se forme une image en MET ? Quelle relation de proportionnalité ?
Les électrons traversent l’échantillon pour former l’image : le nombre d’électrons arrivés au détecteur est inversement proportionnel à la quantité de produit de contraste retenu par les composants cellulaires
À quoi correspondent les zones claires et les zones sombres sur l’image ?
- Zone claires : structures qui retiennent peu de produit de contraste
> Beaucoup d’électrons arrivent au détecteur, qui est donc très brillant
» Zones peu denses aux électrons - Zones sombres : structures qui retiennent beaucoup de produit de contraste
> Peu d’électrons arrivent au détecteur, qui s’illumine donc très peu
» Zones denses aux électrons
Qu’est-ce que la cryofracture ? Comment est-elle obtenue ? À quoi s’adresse-t-elle ? Que permet-elle d’étudier ?
> Réplique métallique d’une surface fracturée
> Obtenue après congélation de l’échantillon
> S’adresse à des objets non-fixés, non-déshydratés et non inclus en résine
> Permet d’étudier les membranes biologiques, d’évaluer la présence de protéines intramembranaires, pouvant être localisées dans le feuillet extracellulaire de la membrane, dans le feuillet intracellulaire de la membrane et dans le feuillet transmembranaires
Quelles sont les 4 étapes de la cryofracture ?
- Fracture : membrane est soumise à un choc, ce qui la casse dans sa zone peu dense aux électrons, puis le feuillet extracellulaire est retiré
- Ombrage : projection des atomes métalliques à la surface du feuillet restant, avec un certain angle (feuillet intracellulaire), ce qui entraine une zone d’ombre à l’endroit où les atomes se déposent moins
- Digestion : partie biologique retirée par digestion à l’acide sulfurique pour ne garder que la réplique métallique
- Observation au MET
Principe de la microscopie électronique à balayage (MEB)
(Métallisation de l’échantillon au préalable)
- Faisceau d’électrons incident balaye la surface : il se décale de proche en proche et créer une ligne d’observation. Ainsi de suite jusqu’à avoir balayé l’ensemble de la surface de l’échantillon
- Par arrivée d’électrons secondaires au détecteur
Que permet d’observer le MEB ?
La forme globale de la cellule (le relief)
En bref, l’application des deux types de microscopie électronique
- MET : structure subcellulaire
- MEB : surfaces, volumes en 3D
Quels sont les deux types de microscopie photonique ? Qu’utilisent-t-elles ?
- Microscopie optique : utilise la lumière blanche (ampoule) comme source lumineuse
- Microscopie à fluorescence : utilisation d’une source laser (photons à même longueur d’onde) comme source lumineuse
Principe de la MP
- Lumière traverse l’échantillon et arrive aux yeux de l’observateur
Composition d’un MP
> À quoi servent ces éléments ?
- Diaphragme : interposé sur le trajet lumineux et conditionne la quantité de lumière transmise (contraste)
- Condensateur : focalise la lumière sur l’échantillon
- Échantillon : déforme la lumière qui le traverse
- Lentilles objectif et oculaire : agrandissent les objets
- Platine : permet de positionner l’échantillon
De quoi dépend le type de photons arrivant aux yeux de l’observateur en MP ?
- Absorption : doivent traverser l’échantillon
- Réflexion : doivent rester dans le champ optique
- Réfraction : doivent entrer et sortir sous un angle précis
- Diffusion : doivent traversés sans être déviés
Comment expliquer la présence de couleurs lorsque l’on utilise un MP ?
L’image est formée grâce aux photons réfractés et diffusés, qui appartiennent au spectre visible.
(La différence de couleurs est liée à la différence d’absorption selon les éléments de l’échantillon)
Principe des colorations de routine et topographiques
> En fonction de quoi ?
Interaction physico-chimique des constituants intra- et extracellulaire avec des substances chimiques (colorants), en fonction de leur charge électrique, de leur hydrophobe et de la taille des molécules de colorant
Qu’est-ce que l’hématoxyline-éosine (HE) ? Quelle est sa composition ? Sa charge ? Comment interagit-elle ?
- Coloration standard, topographique, fréquemment utilisée
- Composition :
> Hématoxyline : charge positive
> Éosine : charge négative - Interaction selon la charge :
> Si charge globale = positive : interaction avec charge négative (éosine) et donc marquage en rose
> Si charge globale = négative : interaction avec charge positive (hématoxyline) et donc marquage en bleu/violet
Définition : colorant topographique
Colorant permettant de réaliser une carte générale de l’organe/du tissu
Quels sont les 2 exemples de colorants de routine topographiques cités dans le cours ?
- Hématoxyline-éosine
- Trichrome
Qu’est-ce que le trichrome ? Quelle est sa composition ? Sa charge ? Comment interagit-il ?
- Coloration à trois couleurs (= coloration trichrome) standard et topographique
Composition :
- Fuchsine et ponceau rouge : charge négative
- Hématoxyline : charge positive
- Vert lumière : charge négative
- Interaction selon la charge et la zone :
> Fuchsine et ponceau rouge : interaction avec charge positive (cytoplasme rose/rouge)
> Hématoxyline : interaction avec charge négative (noyau bleu/noir)
> Vert lumière : interaction avec charge positive (collagène, fibre de l’espace extracellulaire vert)
Quelle autre propriété des colorants entre en jeu dans le trichrome ? Pour quelle coloration ? Que change-t-elle ?
Le poids moléculaire
> Fuchsine de petite taille : traverse facilement et rapidement le maillage serré du cytosquelette cellulaire et cilié
> Vert lumière de grande taille : entre difficilement dans les cellules mais se fixe dans les mailles larges des fibres de l’espace extracellulaire
Pourquoi ne peut-on pas se contenter de colorations de routine ? Qu’utilise-t-on alors ?
- Cellules contiennent des composés chimiques particuliers liés à leur fonction
> Nécessité d’utiliser des colorations spéciales (colorent des constituants aux propriétés identiques) pour mettre ces composés en évidence
Quels sont les 3 exemples de colorations spéciales cités dans le cours ?
- Periodic Acid Schiff (PAS)
- Perls
- Huile rouge
Que met en évidence le PAS ? Quels constituants précisément ? En quelle couleur ?
Colore les constituants aux arborisations sucrées (glycogène, glycocalyx) en rose, mais aussi le collagène
Qu’est-ce que le glycogène ?
Réserve intracellulaire du glucose
Qu’est-ce que le glycocalyx ?
Résidus sucrés extracellulaire des protéines et des lipides du feuillet externe de la membrane cellulaire
Que met en évidence le Perls ? En quelle couleur ?
Permet d’évaluer les réserves de fer stockées dans l’organisme
Fer intracytoplasmique (Fe3+) se colore en bleu
Que met en évidence l’huile rouge ? En quelle couleur ? Quelle autre propriété entre en compte ?
- Permet d’évaluer les réserves de lipides
- Lipides apparaissent en rouge brillant
- Hydrophobicité entre en jeu : plus soluble dans les gouttelettes lipidiques intracellulaires
Principe Hybridation in situ
> Comment ?
> Avec quoi ?
- Reconnaissance de l’ADN/ARN complémentaire par un fragment court d’ADN ou d’ARN (=sonde), couplée à un fluorochrome ou à une enzyme
Quelles sont les deux manières de reconnaître l’ARN X et l’ARN Y du cytoplasme cellulaire ? Qu’utilisent-elles ? Comment ? Avec quoi ? Quel type de microscope ?
- Pour ARN X : Méthode FISH
> Utilisation d’une sonde spécifique anti-X, couplée à un fluorochrome qui émettra une lumière lors de son exposition à la lumière
> Utilisation du microscope optique à fluorescence - Pour ARN Y :
> Utilisation d’une sonde spécifique anti-Y, couplée à une enzyme, dont le substrat est ajouté au milieu, qui digérera ce dernier en entraînant ainsi son changement de couleur
> Utilisation du microscope optique classique
Qu’est-ce qui diffère entre une cellule normale et une cellule cancéreuse ? Comment cela a-t-il été mis en évidence ?
- Cellule normale : gènes présents en deux copies
- Cellule cancéreuse : nombre de chromosomes peut être augmenté ou diminué
> Mis en évidence par hybridation in situ fluorescente ciblant 2 gènes différents
Comment se répartit l’ARNm du gène PTEN dans le cytoplasme d’une cellule normale ? Et dans celui d’une cellule anormale (cancéreuse) ? Comment cela a-t-il été démontré ?
- Cellule normale : ARNm réparti dans tout le cytoplasme, sous forme de petits foyers
- Cellule anormale : ARNm regroupé sous forme de grands foyers dans certaines régions du cytoplasme
> Mis en évidence par hybridation in situ fluorescente ciblant l’ARNm du gène PTEN
Quelles sont les 3 utilités de l’hybridation in situ ?
- Présence de segments de génome
- Présence d’un type cellulaire dans une structure anatomique
- Identification d’un type cellulaire
Comparaison du syndrome microdéletionel 22q11 chez un sujet normal et chez un sujet malade
- Sujet normal : présence de la région q11 du chromosome
- Sujet malade : absence de la région q11 du chromosome
Principe des immunomarquages
> Comment ?
> Avec quoi ?
- Reconnaissance des protéines intra- et extracellulaires par un anticorps dirigé contre des segments courts (antigènes)
> Anticorps primaire détecté par un anticorps secondaire portant le moyen de révélation : fluorochrome pour MOF ou enzyme pour MO
Antigènes propres à la protéine d’intérêt
Quelles sont les 2 utilités de l’immunomarquage ?
- Pareil que pour l’hybridation in situ : ce sont des techniques complémentaires
- Colocalisation des protéines (complexes protéiques)
Comment est utilisé l’immunomarquage dans la colocalisation ?
Triple marquage par trois anticorps différent aux fluorochromes différents
Principe de l’histoenzymologie
> Que met-elle en évidence ?
> Quelles sont ses 4 particularités au niveau de la préparation des échantillons ?
> Met en évidence l’activité enzymatique d’une enzyme naturelle présente dans la cellule
> Particularité de préparation des échantillons :
- Pas de fixation
- Fixation spécifique dépendant du type d’enzyme
- Pas d’enrobage en paraffine mais congélation à l’azote liquide par exemple
- Coupe à l’aide d’un cryostat (machine refroidie)
Quelle est l’utilité de l’histoenzymologie ?
- Identification de sous types cellulaires
