Les Methodes Flashcards
Objectif du marquage ?
Rend un élément d’intérêt détectable
Définition d’un anticorps
Définition anticorps polyclonaux:
Définition anticorps monoclonaux
Protéine avec un domaine constant et un variable qui se lie de façon spécifique à une région particulière
=épitope
Mélange d’AC reconnaissant plusieurs épitope d’un même antigène
Reconnaissant un seul épitope de l’antigène
Le western blot ? Principe Étape 1) electrophorese 2)transfert sur mbr 3)incubation 4)lavage 5)révélation
Méthode de détection de protéine d’intérêt, séparé par electrophorese à l’aide d’un anticorps marqué
1) SDS page (SDS charge négativement le tout et romp les liaisons non covalante )
Puis migration de la cathode (-) ces l’anode (+)
2) transfert du gel sur membrane (cathode anode)
3) on ajoute les anticorps (si marqué détection directe)
4) élimine les anticorps en excès
5) anticorps marqué qui révèle les premier anticorps (indirecte)
Immunohistochimie ou immunocytochimie ou immunofluorescence
BUT ?
Étape
1) préparation
2) immunodetection
Qu’est ce qui ressort en blanc sur une immunohistochimie ?
Ou la protéine d’intérêt et localisé dans un tissu ?
1) préparation rend accessible la protéine (perméabilise la cellule ou réalisation d’une coupe de tissu)
2) détection avec anticorps directe l’anticorps qui détecte et marqué ou indirect un second anticorps (marqué) détecte le premier
Uniquement ce qui est marqué!
Immunoprecipitation BUT ?
Co-immunoprecipition BUT? Étape 1) 2) 3)
4) WB pour la co-immunoprecipitation
Intérêt ?
Extraire une protéine d’intérêt.
Mettre en évidence une interaction.
1) ajout d’AC -> création d’un complexe AC-AG
2) rend le complexe insoluble grâce à des protéine G
3) centrofugation pour récupérer le complexe
4) WB afin de détecter les interaction
Que met en évidence le DAPI ?
L’ADN
Sonde et hybridation: Principe ?
Reconnais un acide nucléique cible (complémentaire) Grace a une séquence marqué
Culture cellulaire principe ?
3 types:
1) culture organotypique
Avantage
Inconvénient
2) culture de cellule dissocié
Étape a) b) c) d) e)
Avantage:
Inconvénient
3) culture de ligné cellulaire
Avantage
Inconvénient
Maintient en vis des cellule hors de l’organisme
1) conserve l’architecture
durée de vie faible
2) étape
a) dissociation des cellules grace a la trypsine !
b) culture primaire (développement dans une boîte)
c) multiplication
d) repiquage ( encore trypsine )
e) repiquage successif ‼️toujours culture secondaire
Beaucoup de cellule
Durée de vie limite, perte architecture et modification possible
3) cellule rendu immortel
Cultivable indéfiniment
Propriété différente des cellules de base
Condition de culture ?
Température ?
Nutriment ?
37c
Sel minéraux nutriment glucose acide aminés et DES FACTEURS DE CROISSANCE
Cytometrie de flux
But
Exemple avec la quantité ? Permet de ?
Avec différent fluorochrome ?
Détecte et quantifie la fluorescence de cellule ou détecte différent fluorochrome
Déterminer dans qu’elle cycle cellulaire ce trouve une certaine quantité de cellule
Qu’elle cellule exprime qu’elle protéine en fonction du fluorochrome fixé sur chaque AC
PCR et RTPCR
But
Comment ce procéde l’amplification ?
Permet également de ?
PCR: amplifie une séquence d’intérêt
RTPCR transcription inverse puis amplification
Dénaturation du double brin, hybridation d’une amorce puis élongation Grace à une ADN polymerase
Une fois la séquence d’intérêt multiplie ça mise en évidence et plus facile ou juste si il y a amplification c’est que l’amorce c’est fixé donc présence de la séquence d’intérêt !
La microscopie
Résolution
-optique + qu’elle procédé ?
Électronique + qu’elle procédé ?
- 100 a 500 nm. Les photons
- 0,2 a 2nm les électrons
Préparation d’un échantillon pour le microscope optique
9 étapes
1) fixation stabilisé la cellule
2) rinçage (excès de stabilisateur)
3) déshydratation
4) inclusion ( solidifie l’échantillon)
5) microtomisation (coupe fine)
6) réhydratation
7) coloration
8) déshydratation
9) montage
Préparation microscope électronique
9 étapes :
1) prélèvement
2) marquage (éventuelle)
3) fixation
4) post fixation
5) déshydratation
6) inclusion
7) ultramicrotomisation
8) augmente le contraste
9) observation
Le pulse chasse
Pulse =
Chasse =
Que peut t’on observé si on met dans le mileu de l’ATP radioactive ?
Pulse = le marquage d’élément d’intérêt au moment de leur synthèse
Chasse= on observe à différent temps la position des élément marqué
Exemple avec le REG
-une phosphorylation
Patch clamp permet de ?
Étudier les potentiel membranaire
Les protéines de fusion
Permet de ?
Permet de repérer ou d’extraire aisément une protéine d’intérêt
Notamment en tant qu’etiquette
Le fret :
Permet de ?
Exemple d’application
Mettre en évidence l’interaction de deux protéines
Exemple une protéine ( X )liée à une protéine fluorescente ( jaune par exemple)
On fais deux même sur la protéine ( Y liée à une protéine rouge ) dont on veut déterminer l’interaction avec la première.
On excite la première protéine fluorescente : - si on obtient du jaune uniquement pas d’interaction trop éloigné
- si on obtient si rouge ça veut dire que l’excitation c’est transmise donc que les protéines sont liée
-la seconde
Centrifugation ou fractionnement cellulaire
Permet de séparer les différentes fractions subcellulaire
Comment démarrer l’exercice ?
Client décortiquer chaque énoncé ?
1) thème
2) objectif
3) protocole
1) méthode d’analyse ?
2) objectif
3) bilan
Qu’elle est la fonction du triton X 100
1) perméabilise les membranes, se qui peut servir pour une immunohistochimie !
Concernant les microscopes optique,
Qu’elle sont les microscopes permettant de détecter la fluorescence ?
Qu’elle microscope (optique permet de voir des relief ?
1) le microscope confocale et le microscope à épifluorescence
2) microscope à contraste d’interférence ou de nomarski
Qu’elle est l’avantage de travailler in vitro quand a la prédiction de la nature des interaction ?
On sais ce que l’on met dedans, on peux donc dire si l’interaction est directe
Qu’elle est l’effet des mi-ARN ou si-ARN ?
Qu’elle effet cela a sur la protéine ?
Rend l’ARN visée inutilisable
On ne peux prévoir, si elle est stable la quantité de protéine peux rester identique, en revanche si elle est instable elle peux chuter donc pas d’information utilisable sur la quantité de protéine
