Les biomédicaments Flashcards
Quelle est la définition du biomédicament (= médicament biologique) ?
Article L5121-1 du Code de la Santé Publique:
« On entend par médicament biologique, tout médicament dont la substance active est produite à partir d’une source biologique ou en est extraite et dont la caractérisation et la détermination de la qualité nécessitent une combinaison d’essais physiques, chimiques et biologiques ainsi que la connaissance de son procédé de fabrication et de son contrôle. »
Pour développer un biomédicament, il faut comprendre la physiologie et la physiopathologie des maladies. On peut ainsi cibler spécifiquement un événement biologique d’intérêt pour le traitement des maladies.
Quelles sont les principales sources des biomédicaments ? Leurs modes de production ? Donner des exemples de biomédicaments obtenus.
Quelle est la classification des différents types de biomédicaments ?
- Soit il y a utilisation des biotechnologies ( = génie génétique = ingénierie génétique = ADN recombinant) sur le produit biologique source, après l’avoir isolé, pour pouvoir produire différents types de biomédicaments relevant de deux grandes catégories (acides nucléiques et protéines recombinantes).
- Soit il n’y a pas utilisation des biotechnologies sur le produit biologique source. La biomolécule d’intérêt peut être extraite du tissu source (extraction) pour obtenir le biomédicament. Ou bien on utilise les techniques de l’hybridome ou de thérapie cellulaire sur le produit biologique source pour obtenir différents types de biomédicaments.
D’où provient la complexité des médicaments ?
Les médicaments biologiques sont des molécules complexes de par leur taille (le poids moléculaire est généralement élevé).
Mais également de par leurs structures primaire, secondaire et tertiaire: en solution, elles peuvent se retrouver dans différents états structuraux.
Ce mélange de différents variants moléculaires de la molécule active (population moléculaire mixte, ou hétéro- gène) s’explique par le mode de production des biomédicaments: on utilise un système de production biologique (en fait des systèmes cellulaires).
Ce qui est différent du comportement en solution des médicaments de synthèse, car ils ont notamment pu être caractérisés au préalable. Une petite molécule obtenue par synthèse chimique → une population moléculaire homogène et facilement reproductible.
Quelle est la base préalable au génie génétique ?
La cellule constitue la base du génie génétique: c’est la plus petite unité structurale d’un organisme douée d’un fonctionnement autonome. Toutes les cellules présentent les mêmes caractéristiques: elles naissent, se nourrissent, se divisent puis meurent.
Quelles sont les caractéristiques des cellules procaryotes et celles des eucaryotes ?
Quelles sont les 3 biomolécules sur lesquelles repose la vie ?
- L’ADN contient la mémoire (information génétique) de la cellule. L’unité d’information est le gène, constituée d’une portion ou séquence d’ADN
- L’ARN est la matrice utilisée pour la synthèse des protéines (ARNm, ARNr, ARNt)
- Les protéines déterminent non seulement la structure (morphologique) des cellules mais aussi leurs fonctions.
En quoi le génie génétique diffère d’un procédé naturel ?
Le génie génétique détourne cet événement biologique naturel de transcription/traduction pour la production des biomédicaments. En partant d’un ADN donné comportant un gène d’intérêt (que l’on va insérer dans un vecteur que l’on va mettre dans une cellule hôte, procaryote ou eucaryote ou bien un organisme hôte, selon ce que l’on veut produire), on va aboutir au biomédicament recombinant voulu (protéine recombinante ou bien acide nucléique recombinant).
Quelle est la définition du génie génétique ?
Le génie génétique ou ingénierie génétique ou biotechnologie ou technologie de l’ADN recombinant vise à utiliser, modifier ou reproduire le génome des êtres vivants.
Quels sont les principes du procédé de génie génétique ?
Il utilise des outils biologiques et des techniques de biologie moléculaire complexes et liés à la maîtrise du vivant, permettant de manière contrôlée et chronologiquement:
- D’isoler l’ADN contenant le gène d’intérêt en extrayant l’ADN du génome de la cellule ou bien d’isoler l’ARNm de la protéine d’intérêt puis transcrire in vitro cet ARNm en séquence d’ADN complémentaire (ADNc) à l’aide de la Transcriptase inverse (enzyme de type ADN polymérase)
- De modifier et d’amplifier ce matériel génétique (ADN ou ADNc)
- De le caractériser (généralement par séquençage) afin de vérifier que l’ADN isolé correspond bien à l’ADN voulu au départ
- De purifier le vecteur, molécule d’ADN qui permettra de transférer le gène d’intérêt à la cellule ou à l’organisme hôte
- De couper l’ADN de matière définie et reproductible, à l’aide d’une enzyme de restriction afin d’isoler le gène d’intérêt
- De couper le vecteur avec la même enzyme de restriction (ainsi, les paires de bases du vecteur et du gène seront complémentaires au niveau du site d’insertion du gène)
- D’intégrer le gène d’intérêt dans le vecteur purifié, molécule d’ADN utilisée comme outil de transfert (véhicule) de matériel génétique (c’est à ce moment que l’ADN devient “recombinant”) . Les vecteurs sont ensuite recollées grâce à une ligase.
- De transférer le vecteur dans une cellule hôte (ou bien un organisme hôte). Ce procédé s’appelle la transgénèse.
- De cloner les cellules hôtes puis de les faire s’exprimer (expansion des cellules hôtes).
- De mettre en culture l’hôte (bien évidemment quand il s’agit de cellules hôtes) et de sélectionner, donc, les cellules hôtes. La sélection permet de ne garder que les cellules hôtes qui ont bien intégré le vecteur (car il y a toujours une part d’échec).
Quelles sont les étapes de la phase industrielle du biomédicament ?
Ensuite, il y a la phase industrielle, qui va aboutir in fine à la production du biomédicament. Elle ne fait pas intervenir le génie génétique. De fait, elle n’est en soi n’est pas spécifique du génie génétique. Chronologiquement, elle suit les étapes suivantes:
- Production industrielle: les cellules hôtes sont cultivées en volume très important dans des bioréacteurs afin d’avoir une production conséquente de biomédicament
- Purification et caractérisation du biomédicament
- Contrôles qualités (reproductibilité, spécificité, affinité, pureté)
- Conditionnement
Quelles sont les propriétés des biomolécules recombinante (taille, production, cible, spécificité, liaison, administration, biodistribution, métabolisme) ? Comparer avec les molécules de synthèse.
Décrire l’histoire de la production de l’insuline humaine, exemple d’une protéine thérapeutique recombinante ?
1923: Des expériences d’ablation du pancréas ont mis en évidence son rôle dans le contrôle de la glycémie: découverte du rôle de l’insuline (Banting, Best, Collip et McLeod (Canada)).
1928: Extraction de l’insuline à partir du pancréas de porc et de bœuf. Mais problèmes d’immunogénicité (le système immunitaire du patient détruit l’insuiline injectée car il s’est immunisé et a produit des anticorps dirigés vers cette molécule animale étrangère).
1970 : Modification enzymatique (=biotransformation), de l’insuline de porc qui ressemble ainsi d’avantage à l’insuline humaine. Mais problème de désensibilisation à cette insuline.
1980: Production de l’insuline recombinante grâce à la bactérie E coli (elle contient le plasmide, qui est le vecteur utilisé et elle sera aussi utilisée comme cellule hôte). Il s’agit de la première protéine recombinante mise sur le marché.
Que sont les anticorps ?
Un anticorps (Ac), ou immunoglobuline (Ig), est une protéine produite par le système immunitaire (par les plasmocytes issus des lymphocytes B) en réponse à un antigène (Ag) qui a été reconnu.
Qu’est ce qu’un anticorps monoclonal ?
Un anticorps monoclonal (AcM) est un anticorps reconnaissant un seul épitope sur un antigène donné: il est par définition produit par un seul clone de plasmocyte.
Un AcM a en moyenne un PM de 150.000 Da: très lourd, il ne peut être éliminé par voie urinaire
Qu’est ce qu’un anticorps polyclonal ?
Un anticorps polyclonal est un anticorps qui reconnait plusieurs épitopes sur un antigène donné (voire même tous les épitopes présents sur l’antigène).
Comment un anticorps reconnaît un antigène ?
Un Ag peut être reconnu de différentes manières par différents Ac. Chacun des sites de reconnaissances sur l’Ag (= épitopes) répond à une manière différente de reconnaissance par un Ac.
Les parties de l’Ac qui reconnaissent les épitopes se trouvent dans les domaines variables de l’Ac (au niveau du fragment Fab, aux extrémités des chaines lourdes et légères).
Chaque épitope a une structure différente: un Ac reconnaissant un épitope donné d’un Ag donné
n’aura donc pas forcément la même spécificité pour cet Ag qu’un autre Ac qui reconnaîtra un autre
épitope sur le même Ag. Si deux industriels font chacun un AcM pour un Ag donné, ils ne seront donc pas forcément identiques (différences en terme de bioactivité et de biotoxicité notamment).
Quelles sont les 2 étapes pour produire des anticorps monoclonaux recombinant ?
- une étape de production d’AcM non recombinant: hybridation cellulaire
- une étape de production d’AcM recombinant: génie génétique
Comment à lieu l’hybridation cellulaire pour la production d’AcM non recombinant ?
La technique de l’hybridome ( = hybridation cellulaire = fusion cellulaire) permet d’immortaliser un clone de plasmocyte, pour produire toujours le même anticorps monoclonal.
1) Immunisation des souris avec l’antigène (ou la protéine) d’interêt: les lymphocytes B (ils possèdent l’enzyme HGPRT) des souris vont se différencier en plasmocytes qui vont alors produire des Anticorps dirigés contre l’antigène (ou la protéine).
2) Prélèvement des organes lymphoîdes secondaires (où se trouvent les lymphocytes B: principalement la rate) des souris immunisées préalablement.
3) Fusion (en milieu contenant du PEG) des lymphocytes B avec des cellules immortalisées d’une lignée myélomateuse (elle n’expriment pas HGPRT): formation des hybridomes.
4) Croissance des hybridomes avec un milieu sélectif HAT (Hypoxanthine Aminopterine Thymidine): les cellules qui ne possèdent pas l’HGPRT meurent. De fait, seules les cellules myélomateuses ayant fusionné avec les lymphocytes B survivent: ainsi, on ne sélectionne que les hybridomes.
5) Criblage afin de ne garder que les hybridomes qui produisent l’AcM non recombinants d’intérêt (Tests en culture: immuno-précipitation, ELISA; RIA… )
Comment intervient le génie génétique dans la production d’AcM recombinant ?
Suite à l’étape de criblage, qui a préalablement permis de sélectionner et mettre en évidence les hybridomes d’intérêt (qui produisent les AcM non recombinants d’intérêt), on va pour une production de masse, utiliser les techniques de génie génétique. On va alors enfin produire des AcM recombinants (puisqu’on va faire de l’ADN recombinant).
Le déroulé du procédé est le même que le procédé du génie génétique classique, les seules particularités notoires sont les suivantes: on isole l’ADN des hybridomes d’intérêt. On insert cet ADN dans un vecteur que l’on va transférer dans une cellule hôte eucaryote (généralement des cellules CHO). Ce sont les cellules CHO qui vont être clonées pour produire les AcM recombinants.
Enfin, les étapes industrielles, non spécifiques au génie génétique et qui terminent le processus de fabrication sont: production industrielle (en bioréacteur), purification et caractérisation, contrôles qualités, conditionnement.
Expliquer l’exemple des souris transgéniques humanisées (HuMAb-mouse)
En fait, lors de la production d’AcM (recombinants ou pas) il y a dans la plupart des cas une étape préalable, avant même l’étape d’immunisation de la souris (c’est à dire la première, celle où l’on injecte à la souris l’antigène ou la protéine d’interêt). Il s’agit de produire des souris humanisées par le biais des techniques de génie génétique. Le fait d’humaniser une souris permet ici à la souris d’avoir un système immunitaire humain. Du coup, lors de l’étape d’immunisation, injecter un Ag (ou une protéine) à une telle souris lui permet de produire des Ac humains.
Si la souris n’est pas humanisée au préalable, elle garde donc un système immunitaire de souris. L’Ac qu’elle va produire en réponse à l’Ag injecté sera alors un Ac de souris. En post-hybridome, on aura bien production d’AcM, mais de souris.
