Lecture 4 Flashcards
Production of aminoacids by regulatory mutants of unbranched pathways: L-Proline
La L – prolina se obtiene a partir de glutamato por fermentación con Serratia marcescens. Cuando hay un exceso de prolina, ésta se una a la glutamato quinasa inhibiendo su propia síntesis. Por tanto, necesitamos un mutante para la glutamato quinasa que no pueda reconocer prolina. Para seleccionar al mutante utilizamos análogos estructurales tóxicos de la prolina, de manera que solo crecerán las bacterias mutantes. También se necesita desactivar la prolina oxidasa (degrada la prolina). Al ser un osmoprotector, un medio con alta concentración de sal incrementará la producción la prolina. Se pueden sobreexpresar los genes de biosíntesis por clonación.
Production of aminoacids by regulatory mutants of unbranched pathways: L-Histidine
En el caso de la histidina debemos inhibir la histidinasa, así como inducir mutagénesis con selección por análogos estructurales para inhibir el feedback de la adenil transferasa. No se consiguió aumentar la producción ya que el feedback solo estaba inhibido parcialmente; es más, cuando se consiguió la inhibición total tampoco aumentó la producción debido a la existencia de una ruta adicional que no funcionaba a la velocidad suficiente para recuperar el ATP (enzima AICAR). Por lo tanto, se requiere un mutante que inhiba histidinasa / adenil transferasa a la vez que sobreexpresa AICAR.
Production of aminoacids by regulatory mutants of branched pathways: Aspartate
A partir del aspartato se producen cuatro aminoácidos (isoleucina, treonina, metionina, lisina) que controlan tanto al primer enzima de su ruta como la aspartato quinasa.
Production of aminoacids by regulatory mutants of branched pathways: Aspartate E.coli
En el caso de Escherichia coli hay tres aspartato quinasas de modo que cada aminoácido (no isoleucina) inhiba una sin bloquear totalmente la síntesis.
Production of aminoacids by regulatory mutants of branched pathways: Aspartate B. flavum
En bacterias del suelo (Brevibacterium flavum) que viven en medios con menos nutrientes la regulación es más fácil pues solo está controlada por dos aminoácidos (lisina / treonina).
Para encontrar una cepa únicamente productora de lisina necesitaríamos únicamente un mutante para la homoserina deshidrogenasa, pero se volvería auxótrofo para metionina, treonina e isoleucina. Utilizando análogos de lisina se podría encontrar un mutante que tenga el feedback de la aspartato quinasa inhibido (solo treonina la regularía). Sin embargo, estos mutantes suelen crecer peor que el organismo silvestre, por lo que se suele recurrir a la fusión de protoplastos. Entre las células hijas debemos buscar aquellas con mayor producción del metabolito que crezcan rápido. Al fomentar el crecimiento se pueden realizar más fermentaciones en el mismo tiempo, obteniendo más producto.
Aminoacid production with enzymes: characteristics
- Permite una producción en altas concentraciones
- Necesita pocos reactivos
- Tiene una tasa de producción por unidad de volumen muy alta; pero requiere de la purificación de los enzimas o de reactivos de partida muy caros.
Aminoacid production with enzymes: Aspartase
La aspartasa degrada el aspartato formando fumarato, sin embargo, en industria se puede revertir el sentido de la reacción administrando aspartato. Necesitamos una producción continua del enzima (se acaban inactivando) por lo que podemos unir la aspartasa a una columna pasando una solución con fumarato (o añadir una Escherichia coli que produzca activamente la enzima). Al tratarse de un enzima de degradación debemos proporcionar aspartato al inicio para inducir al enzima. También se puede sobreexpresar la aspartasa bajo un promotor constitutivo o inducible que se pueda controlar.
Aminoacid production with enzymes: aspartate 4-decarboxylase
La L-Alanina se obtiene a partir de aspartato por la aspartato 4-decarboxilasa que se puede purificar a partir de Pseudomonas dacunbae o se puede introducir en Escherichia coli para fijarla a la columna. Se pueden acoplar dos columnas para evitar que se vuelva a degradar el aspartato por su aumento.
Aminoacid production with enzymes: hydrolase & racemase
La L-lisina se obtiene a partir del DL-α-amino-ε-caprolactama utilizando la hidrolasa de Cryptococcus laurentii con una eficacia del 50% (mezcla racémica). Utilizando la racemasa de Achromobacter obae podemos transformar el isómero D remanente en el L (hidrolasa) con un 100% de rendimiento.
