Lecture 2 Flashcards
Pasos a seguir en la obtención de proteinas:
Para obtener las proteínas, primero debemos separarlas del resto de componentes celulares y, una vez obtenido el pool proteico, utilizaremos técnicas cromatográficas para aislar la proteína de interés.
Técnicas cromatográficas para el aislamiento de proteínas:
- Absorción: separación por afinidad de la proteína a la matriz mediante puentes de hidrógeno y/o fuerzas de Van der Waals –> Elución en gradiente aumentando la concentración de fosfato.
- Afinidad: interacción específica con el ligando unido covalentemente a la matriz –> Elución por cofactores, sustratos, cambios de pH o de concentración de sal.
- Quelación metálica: mediante matrices presentando iones metálicos unidos para los cuales presenta afinidad la proteína –> Elución con soluciones de ligandos que se unan al metal desplazando a la proteína.
- Filtración en gel: separación por tamaño molecular (las proteínas voluminosas eluyen en primer lugar) con una fase estacionaria compuesta de polímeros porosos.
- Intercambio iónico: separación en función de la carga (punto isoeléctrico) por fuerzas electrostáticas dependientes del pH de la solución –> Matriz de celulosa substituida por grupos cargados (cationes o aniones) o Elución en gradiente aumentando la concentración de fosfato.
- Hidrofobicidad: por interacción con matrices conteniendo grupos funcionales hidrofóbicos –> Elución mediante la alteración de la fuerza iónica o cambio de pH.
- Líquida de alta resolución (HPLC): a alta presión usando columnas con matrices de sílica.
- ¿antibody affinity cromatography?
Define diálisis o electrodiálisis
La diálisis o electrodiálisis permiten eliminar iones inorgánicos y pequeños solutos de la preparación mediante ósmosis y uso de membranas recubiertas de resinas intercambiadores de iones
Cuantas columnas se usan?
Casi ninguna proteína se puede separar utilizando una única columna de cromatografía, sino que se utilizan varias, detectando la fracción en la que se encuentra la proteína buscada, y utilizándola en otra columna, hasta que finalmente obtengamos la proteína purificada. Una vez obtenida, hay que verificar la pureza y la actividad específica.
Características de la proteína purificada
El grado de pureza necesario depende de la aplicación de la proteína siendo baja en aplicaciones industriales, pero elevada en ciencia, alimentación o farmacia. Tras la purificación, se debe comprobar la temperatura ideal de almacenamiento, para que no ocurra una pérdida de actividad, así como el efecto de aditivos.
Producción de proteinas recombinantes:
La producción de proteínas recombinantes en hospedadores heterólogos requiere de manipulación genética, aunque la purificación es igual que si el hospedador fuera nativo, con la ventaja de que el rendimiento es mayor, ya que se produce mayor cantidad de proteína.
Expresión Nativa (+) Vs. Expresión heterologa (-)
+ Estructura funcional correcta
+ Expresión constitutiva
+ Producción limitada
+ Modificaciones postraduccionales
+ Proteína nativa
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- Estructura funcional indefinida
- Expresión constitutiva o inducible
- Sobreexpresión
- Sin modificaciones en procariotas
- Cuerpos de inclusión
Para que se usan las etiquetas de afinidad?
Las etiquetas de afinidad son una serie de aminoácidos adicionales que se añaden al final de la proteína recombinante para facilitar los procesos de purificación permitiendo, por ejemplo, utilizar una única columna de purificación. Se pueden añadir a ambos extremos de la proteína, pero se debe comprobar que no alteran la actividad de la proteína. En muchos casos llevan “linkers” asociados que aportan sitios de corte reconocidos por proteasas específicas que permite eliminar la cola de afinidad.
Como se puede mejorar la producción?
Para mejorar la producción se pueden introducir modificaciones en el hospedador como mejorar los sistemas de transporte, aumentar la eficacia de los sistemas de producción, modificar el contenido en chaperonas (facilita el plegamiento de las proteínas) o eliminar proteasas.
Existe algún problema a la hora de expresar las proteínas eucariotas?
A la hora de expresar proteínas eucariotas tenemos un problema, pues la proteína está determinada por su mRNA (sin intrones) lo que requiere el uso de transcriptasa inversa para obtener cDNA a partir del mRNA modificado. También hay diferencias en tamaño o modificaciones postraduccionales.
Tipos de enzimas de restricción:
Class I) cleave 100-1000 pb away from the recognition site and currently are or limited use
Class II) cleave very near a specific recognition sequence and are used to cleave double standed DNA at specific sites; they consist of one protein which cleaves the DNA and the second one methylates the DNA
Class III) cleave 25/27 pb from their recognition site and are gaining popularity in some cloning strategies; they carries out both funtions modifications and restriction (dependent of ATP)
Donde se deberían producir estas enzimas de restricción?
Un mismo microorganismo puede producir varios enzimas de restricción, lo que dificulta los procesos de purificación (→ debe ser del 100%). Por ello, resulta útil la producción heteróloga de estos enzimas en microrganismos como Escherichia coli; sin embargo, se debe proteger a éste del propio enzima de restricción, por ejemplo, añadiendo al hospedador una metiltransferasa adecuada.
Dentro de los enzimas destinados a la industria alimentaria háblame de la transglutaminasa
La transglutaminasa es un enzima que permite fusionar proteínas al unir el CO – NH2 de la glutamina con el grupo NH2 de la lisina (con liberación de amonio) generando cadenas interconectadas que aportan una mayor retención de agua o elasticidad, al igual que evitan la formación de espumas. Se obtiene de Streptomyces ya que presenta mejores rangos de temperatura o pH. Generalmente se emplea en productos alimentarios, especialmente cárnicos, pero puede ser útil para generar estructuras que permitan crecer células humanas para reparar tejidos dañados.
Dime lo que sepas de los enzimas destinados a la producción de biofuels
Existen enzimas vegetales destinados a la degradación de fibras vegetales para la obtención de azúcares que pueden ser convertidos en combustibles por fermentación (biofuel 1ª generación). Más tarde, se descubrieron microorganismos que producían estos enzimas de manera natural, por lo que realizan desde la producción del azúcar hasta su transformación (biofuel 2ª generación).
