le microscope electronic ? Flashcards
pourqoi on utilise le microscope electronic?
car il a :
Résolution et grossissement plus importants
Observation des organites cellulaires et leurs détails
au contraire le microscope optique:
Résolution et grossissement limités
Observation de la structure générale des cellules
citer les différent types de microscopes electronique?
Microscope électronique à transmission (MET):
Observer l’intérieur de la cellule
Microscope électronique à balayage (MEB):
Observer l’extérieur de la cellule (3D)
Donner le principe de fonctionnement du microscope électronique à transmission (MET)?
Limite de résolution = 0,2 nm à 2 nm
Le MET fonctionne également selon le principe de transmission
Le MET fait passer sous vide le faisceau d’électrons à travers une coupe ultrafine d’un échantillon biologique. Ce faisceau est ensuite agrandi par des lentilles électromagnétiques et vient former une image sur un écran ou sur un film photographique
Image en noir et blanc
Objectif 1: Principe de fonctionnement du MET
lister les constituants principaux du MET
du MET est composé de :
ensemble de pompage: assurer un vide convenable canon à électrons: produit un vaisseau d’électrons lentilles magnetic: les lentilles condonseur objectif et intermédiaire
étage -porte échantillon: permet l’introduction des échantillons
Résolution
0,2 à 2 nm
Grossissement
100 000 X
Citer les étapes préparatoires d’un échantillon en vue de sa caractérisation ultrastructurale (technique des coupes minces et contraste positif) ?
La Microscopie Électronique en Transmission (MET) permet une analyse morphologique, structurale et chimique d’échantillons solides à l’échelle atomique. Cette technique repose sur l’interaction des électrons avec la matière et la détection des électrons ayant traversé l’échantillon. Les échantillons étudiés doivent donc être préalablement amincis afin d’être transparents aux électrons
Principe : réaliser des coupes ultrafines permissives aux faisceaux d’électrons et aux sels de métaux lourds
Etapes de préparation?
1-Prélèvement
2-Fixation
3-Déshydratation
But de fixation ?
maintenir l’état la plus proche du vivant
Méthodes de fixation ?
Chimique: •Glutaraldéhyde •tétraoxyde d’osmium Physique Cryofixation: التثبيت بالتبريد •Azote liquide •Utilisation d’un cryo-microscopie électronique
fixation ?
♦ 1er bain (2h30) dans le Glutaraldehyde: fixe les protéines , les sucres , acides nucléiques
♦ Lavage dans une solution tamponnée
♦ 2ème bain (1h) dans le Tétroxyde d’osmium: fixe les lipides
♦ À la sortie de l’acide osmique, le prélèvement est entièrement noir
but de désidratation ?
But: enlever l’eau des tissus prélevés et le remplacer par un milieu miscible قابل للامتزاج avec le milieu d’inclusion
domain de l’utilisation ?
☞ Ultrastructure cellulaire (organites) après coloration positive
☞ Aspect morphologique des bactéries et des virus après coloration négative
☞ Structures cellulaires isolées ou macromolécules par ombrage métallique
La Microscopie Électronique en Transmission (MET) permet qoi ?
La Microscopie Électronique en Transmission (MET) permet une analyse morphologique, structurale et chimique d’échantillons solides à l’échelle atomique
a qoi repose la tecnique de fonctionnement de met?
→ Cette technique repose sur l’interaction تفاعلات des électrons avec la matière
→ et la détection des électrons ayant traversé l’échantillon.
→ Les échantillons étudiés doivent donc être préalablement amincis (trés mince) afin d’être transparents aux électrons
citer le principe de la met?
réaliser des coupes ultrafines permissives aux faisceaux d’électrons et aux sels de métaux lourds
les étape de la déshydratation ?
♦ Déshydratation dans des bains successifs d’alcool de plus en plus concentrés jusqu’à l’alcool absolu
♦ Imprégnation dans un solvant de la résine, comme l’oxyde de propylène (la résine sera utilisée dans l’étape de l’inclusion)
but d’inclusion ?
imprégnation du tissu par un milieu capable de durcir fortement pour permettre la coupe par la suite
تشريب النسيج بوسط قادر على التصلب بقوة للسماح بالقطع اللاحق
les étape de l’inclusion ?
♦ Milieu utilisé: Résine (Epon) الوسيط المستخدم
♦ Propriété de polymériser donc durcir à la chaleur ♦ خاصية البلمرة وبالتالي تصلب في الحرارة
♦ Mélangeur pendant 3h
♦ Enrobage dans des moules spéciaux
♦ Polymérisation à l’étuve (37C /45C/ 60C) البلمرة في الفرن
le but de la coupe ?
Coupes ultrafines de 300 – 600 Å (30-60 nm)
Utilisation d’un ultra-microtome
pour récupéré les coupe il utilise de Petit bac rempli d’eau pour récupérer les coupes ultrafines très fragile
Coupes étalées sur une grille métallique(en cuivre)
But de coloration ?
augmenter le contraste des structures cellulaires en augmentant leurs densité aux électrons
Comment c’est fait la coloration ?
Coloration aux sels de métaux lourds
Acétate d’uranyl : ADN, protéines, sucres
Citrate de plomb: ARN et lipides (membranes
attention sur le terme coloration ?
Le terme « coloration » a été mis entre guillemets car ce n’est pas une coloration à proprement parler, mais un procédé qui vise à augmenter le contraste en utilisant les métaux lourds et non les colorants classiques
observation ?
Image en noir et blanc
Régions opaques et sombres : régions plus denses aux électrons (arrêt des électrons)
Régions claires : transmission des électrons
Différents procédés de contraste électronique?
.Coloration positive
•Coloration négative
•Ombrage métallique
Contraste positif (=coloration positive)?
Les atomes majeurs de la matière biologique sont transparents aux électrons d’où la nécessité d’utiliser des sels de métaux lourds: Acétate d’Urany, Citrate de Plomb
♦ But: Décrire finement l’ultrastructure intracellulaire
Contraste négatif (=coloration négative): le principe?
♦ Le principe consiste à déposer tout autour de l’échantillon une couche de métaux lourds
♦ Il permet d’assombrir le fond sans colorer l’objet lui-même. Les structures apparaissent en « négatif » : en clair sur fond sombre
Contraste négatif (=coloration négative): le but?
Observer les structures de très petites dimensions après isolement
Description morphologique (morphologie externe) de macromolécules, d’organites, de ribosomes, de virus , bactérie,,,
Architecture moléculaire des éléments du cytosquelette (microtubules, microfilament d’actine..), de la chromatine, des pores nucléaires,
Ombrage métallique?
♦ Consiste à vaporiser sous vide et sous un angle donné une très fine couche métallique (platine) se déposant sur la surface de petites particules isolées, créant un effet d’ombre
but d’ombrage métallique ?
♦ obtenir un effet d’ombre (morphologie ) de la surface des petites particules isolées ; bactéries, virus, ADN, protéines. Elle a l’avantage d’obtenir une image 3D en MET (car la 3D on l’obtient surtout par le MEB).
but de Contraste positif (=coloration positive)?
But: Décrire finement l’ultrastructure intracellulaire
