Laboratorio ADN Flashcards
Cual es la diferencia entre ARN y ADN?
ARN en lugar de timina tiene uracilo
Quienes tienen más pares de bases de ADN?
Humanos que bacterias
Como se define la técnica de extracción del ADN?
Función del organismo, célula y objetivo que se obtiene de la extracción
Cual puede ser El Paso previo a muchas técnicas?
PCR: Amplificar ADN
Electroforesis
Southern blot: Indentificar secuencias
Cual puede ser la matriz para extraer los ácidos nucleicos?
Sangre, LCR, secreciones, biopsias, médula ósea, tejidos, virus en muestras respiratorias, suelo y agua
Cual AN se degrada más fácil?
ARN
Que interferencias deben ser removidas?
Soluciones purulentas y mucoides
Que aspecto del tipo de microorganismo se debe considerar?
Si es Gram positiva o gram negativa, si tiene una pared rica en ácidos micólicos, hongos, virus
Por qué hay que considerar cantidad de microorganismos?
En un cultivo con muchas bacterias, en una meningitis purulenta donde se espera alta carga y una sepsis temprana en la que el volumen sanguíneo puede disminuir la carga
Cuales son las fases de infección y cuál es la carga de AN?
Agua: mucho agente infeccioso, mucho ADN
Crónica: no hay multiplicación activa de agente infeccioso
Post tratamiento o post Morten: baja carga microbiana, material genético puede estar fragmentado
Cual es el resultado esperado de la extracción?
Rendimiento, pureza y hay que ver el tiempo que requiere la extracción para seleccionar la técnica
Qué hay que tomar en cuenta con las plantas para la extracción?
Que entre más maduras tienen más interferencias y después se congelan con nitrógeno
Por qué las muestras de plantas y animales se congelan con nitrógeno?
Porque a temperaturas altas se degradan y el nitrógeno no forma cristales que rompan las células, se recomienda partir la muestra en pedazos para no estar congelando y descongelando, y mantenerla en buffer para evitar la degradación
Cuales son los pasos de la extracción de ADN?
Ruptura mecánica de tejidos y lisis celular
Separacion de ácidos nucleicos de restos celulares
Eliminación de restos celulares
Precipitación de ADN
Conservación de ADN
Como se hace la ruptura mecanica?
Depende de la muestra si es necesaria, con nitrógeno líquido, con homogeneizadores en frío y artesanalmente en mortero o licuadora
Cual es la ruptura que si o si hay que hacer requiera o no mecánica?
Química
Como se hace la ruptura química?
Homogeneización con agentes químicos la muestra se mantiene a temperaturas elevadas con detergentes, proteasas y agentes caotrópicos, para romper unión entre células y romper membrana celular, en tejidos fibrosos es recomendable cortarlo antes
Que es la lisis celular?
Romper estructuras que confinan el citoplasma y así liberar su contenido
Como se puede hacer la lisis celular?
Altas temperaturas
Empleo pH alcalino
Sonicadores: por ondas sonoras
Bead-beater: gira y rompe células
Lisis hipotonica: célula explote
Cuales pueden ser reactivos para la lisis celular?
Buffers y proteinasa K
Agentes caotrópicos como sales
Detergentes
Que es la proteínasa K y cuales son sus características?
Enzima proteílica que es la serina proteasa
Temperatura de 20-60
Amplio espectro
Corta enlaces peptidicos a la par del grupo carboxilo de aminoácidos alifáticos y aromáticos
Ph óptimo entre 4-12
Estable con ion calcio
No dejar menos de 5 min
Quien complementa la acción de proteinasa K y como?
El fenol-cloroformo y lo hace con la desnaturalización y precipitación de proteínas
Cómo se da la precipitación con etanol frío?
Muestras de pequeño volumen
ADN concentrado
Se almacena muestras más tiempo
Como se da la precipitación con Isopropanol?
Más volumen de muestra
Más rápido
No coprecipitan sales
Que hace el buffer en la extracción?
El EDTA inhibe el calcio, altera el magnesio que es cofactor de nucleadas y estas degradan el ADN
En qué se re suspende el ADN y como se cuantifica?
En buffer y se cuantifica en electroforesis
Como se re suspende y se conserva el ADN con agua y buffer?
Por 6 meses a 4 Celsius
Como se resuspende y se conserva el ADN con etanol + acetato de sodio?
Por 5 años a 70 celsius
Cómo es la relación en la absorbancia 260/280 con la pureza de la muestra?
Entre más pura es la muestra de ADN mayor relación, una que se acerque a dos es muy buena, debajo de 1,6 no, muy para arriba de dos tampoco porque es contaminación con ARN
Cual relación indica que la muestra de ARN es altamente pura?
1,8
Que contaminantes se absorben a 230?
Sales caotrópicas, fenoles o carbohidratos
Cómo calculo la Cn de una muestra?
Con ley de beer
A=ECL
Se toma en cuenta FD
Como calculo pureza de extracción?
Absorbancia a 260/ Absorbancia a 280
Que ventajas tiene el kit comercial sobre el método tradicional?
Menos tiempo
Menos errores
Menos contacto con sustancias tóxicas
Que desventajas tiene el kit comercial sobre el método tradicional?
Mejor rendimiento y más caro
Cuales son cuidados a la hora de realizar extracción?
Rápido
Baja temperatura: no se degrade ADN
Guantes
Mascarilla para evitar contaminación con mi ADN
Que es la electroforesis?
Permite separación de moléculas según su movilidad en un campo eléctrico
Que determina la velocidad de migración en el campo?
Carga neta de la molécula
Tamaño de la molécula
En extracción de ADN donde se hace la electroforesis?
En un gel de agarosa que es un carbohidrato
Como se separan los fragmentos de ADN en esta electroforesis?
Por tamaño y se requiere un marcador que marque no solo el tamaño sino también la intensidad que es la concentración
Porque la degradación en electroforesis es mala?
Indica contaminación con ARN
