Labo 1 : Précipitation ADN + Gel Agarose Flashcards
Que contient l’ADN?
L’information nécessaire au développement et au fonctionnement de l’organisme.
Qu’a fait M. Fruedrich Miescher en 1869?
il a isolé du noyau des cellules une substance riche en phosphore et l’a nommé nucléine
Qu’a réussit M. Richard Altmann en 1889?
Il a séparé, à partir de la nucléine, des protéines et une substance acide qu’il a nommé acide nucléique
Qu’a découvert M. Albrecht Kossel en 1896?
Il a découvert les 4 bases azotées (A-C-T-G) dans l’acide nucléique
Qui ont élucidé la structure de l’ADN (double hélice) le 31 octobre 1962?
Watson et Crick
Quelles sont les 4 bases azotées? Quels familles composent ces bases?
Pyrimidine: Cytosine (C) - Thymine (T)
Purine: Adénine (A) et Guanine (G)
De quoi est composé l’ADN?
1 groupement phosphate liée au désoxyribose (sucre) qui est lui aussi lié à une base azotée (nucléotide). Les nucléotides sont reliés entre-eux par des liaisons 3’-5’ phosphodiester
En quoi l’ARN est différente de l’ADN?
- Base azotée U au lieu de T
2. le groupement phosphate est lié à un ribose au lieu d’un désoxyribose
Quel est le produit a prioriser pour faire précipiter l’ADN? Sinon, que peut-on utiliser d’autre?
l'acétate de sodium 0,3 M à pH 5.2 On peut aussi utiliser: acétate d'amonium 2,0M chlorure de lithium 0,8M chlorure de sodium 0,2M
Que contient le tampon TE et à quoi servent chacun de ses composants?
T = Tris (conserve l’intégrité et la stabilité de l’ADN)
E =EDTA (inhibe les nucléases)
Combien de temps faut-il pour précipiter l’ADN sur glace généralement?
10 minutes si l’ADN est suffisamment concentrée ( >10 ng/ul). Pour l’ADN peu concentré, ça peut prendre toute la nuit.
Combien de temps faut-il centrifuger pour recueillir de faibles concentration d’ADN?
Normalement 15 minutes dans une microcentrifugeuse sont suffisantes
Pourquoi lave-t-on le culot à l’alcool éthylique 95% après avoir microcentrifugé?
pour éliminer les sels restant et assécher le culot
Les gels agissent comme un tamis moléculaire, plus les molécules d’ADN sont longues, plus________
leur migration à travers les pores se fait avec difficulté et inversement.
Pourquoi n’utilise-t-on pas le gel de polyacrylamide au lieu de l’agarose?
les pores d’un gel d’agarose sont plus grands. On utilise la polyacrylamide pour séparer des fragments de 0,2 à 30 kb et l’agarose pour séparer des fragments de 1 à 500 nt.
Polysaccharide extrait d’algue rouge?
Agarose
Pourquoi le gel d’agarose est submergé dans la même solution qui à été utilisée pour dissoudre l’agarose?
Car il contient des ions permettant de faire passer le courant électrique plus facilement. Son pH basique charge l’ADN négativement lui permettant ainsi de migrer vers le pôle positif.
Quelles sont les 2 principales fonctions du tampon de chargement 6x?
1- voir le front de migration grâce au bleu de bromophénol
2- augmenter la poussée d’archimède (alourdir les échantillons) pour lui permettre de descendre et rester dans le fond du puits à cause du glycérol.
De quoi dépend la vitesse de migration de l’ADN dans le gel?
- voltage appliqué
- masse moléculaire
- conformation de l’ADN
Comment se fait la migration de l’ADN pour les molécules linéaires?
la migration est inversement proportionnelle à la taille (en nombre de nucléotides)
À des voltages faibles, la vitesse de migration de l’ADN est_____
proportionnelle au voltage appliqué
Comment fait-on pour mesurer la longueur des fragments d’ADN?
La taille du fragment d’ADN (nombre de pb) est mesurée en comparant sa distance de migration à la distance de migration des fragments qui constitue la solution de marqueurs de taille utilisée
Qu’est-ce que le bromure d’éthidium et comment agit-il avec l’ADN? Pourquoi l’utilise-t-on dans la migration du gel?
cation polycyclique qui s’intercale entre les bases d’ADN grâce à sa forme plane.
Les fragments d’ADN qui ont incorporés le Bromure d’éthidium émettent de la fluorescence quand ils sont exposés à la lumière ultraviolette. L’intensité de la bande est proportionnelle à la qté d’ADN dans l’échantillon
Pourquoi le colorant est ajouté uniquement dans le gel et non avant?
Pour limiter la quantité de bromure dans le labo et effectuer une coloration rapide
À quoi servent les marqueurs de taille?
Estimer le nombre de paire de base. Les molécules migrent a une vitesse inversement proportionnelle à leur taille
À quoi sert le co-précipitant rose?
Il précipite de la même façon que l’ADN nous permettant de voir où est le culot quand la quantité d’ADN est trop faible.
Que permet la précipitation de l’ADN?
concentrer l’échantillon
changer de tampon
Quelle est la façon la plus précise d’évaluer la quantité d’ADN?
En faisant une courbe standard de l’aire en fonction de la quantité d’ADN
