Lab/metode Flashcards
Proteinase K
Hvad med nuklease.
Proteinase K: serine-protease der bryder peptidbinding.
Kløver peptid bindinger i nukleaser
Proteinase K fordele → høj aktivitet og stabilitet under tilstedeværelse af de kemikalier, der findes i buffer ATL. Dette gør den effektiv til at nedbryde proteiner sammen med SDS, da den ikke bliver nedbrudt af SDS.
Buffer ATL
Hvordan denaturere ATL cellemembranen?
Anionisk detergent?
Buffer ATL: indeholder sodium dodecyl sulfat (SDS) som denaturerer cellemembranen.
opløse membranen ved at forstyrre de hydrofobiske interaktioner mellem fosforlipiderne, så strukturen bliver ødelagt.
SDS → anionisk detergent, binder den kun til molekyler, der ikke er negativt ladet. På grund af DNA’s negative rygrad undgår den denaturering.
Buffer AL:
Hvordan kan den optimerer muligheden for, at DNA-molekyler binder sig til silicamembranen?
Buffer AL: guanidine hydrochloride (salt) som denaturerer hydrogenbindinger i vand.
Forstyrrer hydrogenbindingsnetværket i vandet, således det er mere termodynamisk favorabelt for proteiner og DNA-molekyler at være denatureret, end at binde sig til vandet → optimerer det muligheden for, at DNA-molekyler binder sig til silicamembranen, som er processens andet step.
Silica membran
Hvordan binder DNA?
Silica membran: DNA binder sig til membranen gennem hydrogen interaktion (pH 7) (silica membran er positiv og DNA er negativ ladet)
Ethanol under DNA binding
Hvordan forøges DNA’s villighed til at binde sig til silica?
Ethanol/saltopløsning: overskydende cellulært materiale, kontaminerede proteiner, lipopolysaccharider og små dele RNA vaskes væk.
Ethanol nedsætter opløseligheden af DNA i vand, hvilket forøger DNA’s villighed til at binde sig til silica.
AW1
Funktion?
Denne høje koncentration af det chaotropiske salt medfører også
Vaskebuffer.
AW1-buffer: indeholder guanidine hydrochloride. Fjerner resterne af proteinerne og sikrer, at DNA forbliver bundet til membranen.
AW1 højere koncentration end i AL bufferen. Denne høje koncentration af det chaotropiske salt medfører også en høj ionisk styrke af bufferen, som gør det muligt at rense DNA’et for lipider og andre makromolekyler, uden at DNA skylles gennem filteret.
AW2
Vaskebuffer.
AW2 er en buffer, som er en 70% ethanolopløsning, der opløser og fjerner overskydende salte, RNA og andre alkoholopløselige molekyler
AW2-buffer: Hjælper med at fjerne guanidin fra silicamembranen
Ethanol for anden gang inden eluering
Ethanol: overskydende proteiner, salte og andre molekyler vaskes væk.
Ethanol fjerner membranen omkring DNA. Da de fleste salte og mikro organismer er opløselige i 70% ethanol benyttes dette og DNA vil derfor være alene i opløsningen.
DNA eluering:
DNA eluering:
Nuclease frit vand: frigør DNA fra membranen.
TAE-buffer (TBE-buffer)
TAE-buffer (TBE-buffer): Til fremstilling af gelen anvendes en buffer. Samme buffer anvendes i elektroforesekarret til at dække gelen. Bufferen skal kunne lede strømmen samt opretholde pH
Hvorfor er det vigtigt at opretholde en stabil pH?
Derudover er det vigtigt at pH holdes stabil, da ladningen i DNA kan ændre sig, hvis pH ændres, hvilket kan føre til strukturændringer, og dette vil give en upræcis separation.
Hvorfor ikke bruge deminiraliseret vand, eller saltvand?
Hvorfor stiger varmen, hvad kan dette betyde for prøven?
Demineraliseret vand er renset for ioner og er således en dårlig strømleder. Hvis demineraliseret vand blev anvendt til gelelektroforese, ville man grundet den manglende ledeevne ikke kunne opnå den ønskede separation af DNA-fragmenterne.
Konduktiviteten øges i takt med, at koncentrationen af ioner i en opløsning øges. Vand fra hanen har derfor en større ledeevne, og saltvand har en rigtig god ledningsevne. Dårlig ledeevne skyldes større modstand, og det resulterer i varmeudviklingen. Altså stiger varmeudviklingen i takt med faldende konduktivitet, og således vil anvendelsen af demineraliseret vand eller postevand i gelelektroforese kunne føre til denaturering af prøven og skade på gelen.
DMSO, Dimethylsulfoxid
Hvorfor er dette vigtigt under PCR?
DMSO: er en meget polær organisk forbindelse, som modificerer molekylers, herunder primeres, mulighed for at danne hydrogenbindinger. I PCR-reaktioner anvendes denne til at svække selv-komplementære forbindelser mellem CG-rige primere eller DNA-sekvenser, der under normale forhold ikke ville amplificeres korrekt.[Hardjasa, 2010] Jo længere en matchende bp-sekvens vil være, jo flere hydrogenbindinger vil dannes, og primere vil derfor have større tilbøjelighed til at binde sig til deres specifikke template-region end til sig selv i tilstedeværelse af DMSO.
PCR-oprensning
Buffer PB
Buffer PE:
PB Indholder guanidine hydrochloride (salt) som påvirker vands interaktioner, som hjælper DNA med at binde til silica membranen. Gør lidt det samme som buffer AL.
Buffer PE er en vaskebuffer som indholder ethanol som fjerne dNTP’er, primers osv.
I DNA oprensning tilføjes proteinase K og ATL først. De ødelægger proteiner og membraner, derefter er det lidt det samme med PCR oprensning. Der er bare ikke grund til at tilføje proteinase K og ATL fordi ?
I DNA oprensning tilføjes proteinase K og ATL først. De ødelægger proteiner og membraner, derefter er det lidt det samme med PCR oprensning. Der er bare ikke grund til at tilføje proteinase K og ATL fordi der ikke er proteiner og membraner i PCR.
