L’utilisation des anticorps en biotechnologie Flashcards
Structure des anticorps
Masse moléculaire d’une Ig≈150 kD
2 chaînes lourdes identiques (5 types de chaînes lourdes: μ, α, γ, δ, ou ε + Existence de sous-classes: γ1, γ2, γ3, γ4
α1, α2)
2 chaînes légènes identiques (2 types de chaîne légère: κ ou λ)
= 2 paratopes identiques
Paratope
partie de la molécule d’anticorps qui interagit avec l’épitope
Epitope
Déterminant antigénique simple. Fonctionnellement, il s’agit de la partie de l’antigène qui interagit avec le paratope
Reconnaissance par les immunoglobulines d’épitopes sur des antigènes natifs:
*Épitopes linéaires ou séquentiels (enchaînement linéaire continu de monomères adjacents (oses, acides aminés). C’est la séquence des motifs qui est importante pour la reconnaissance.
*Épitopes conformationnels
Attention des choix de l’anticorps utilisé en fonction des conditions expérimentales: conditions dénaturantes ou non dénaturantes
Complexe immun ou immun-complexe
Complexe Ag-Ac
Action brève de la papaïne
- Produits obtenus ?
- Caractéristiques des produits ?
- Noms des produits ?
- 2 fragments identiques de 45 kDa
Liaison de l’antigène
Fab (Fragment antigen binding) - 1 fragment de 50 kDa
Cristallisable à froid
Fc (Fragment Cristallisable)
Action brève de la pepsine
- Produits obtenus ?
- Caractéristiques des produits ?
- Noms des produits ?
- 1 fragment de 100 kDa
Liaison et précipitation de l’antigène
F(ab)’2 - Plusieurs oligopeptides
Réduction par du β-mercaptoéthanol
- Produits obtenus ?
- Caractéristiques des produits ?
- Noms des produits ?
- 2 chaînes de 25 kDa
Chaînes légères
Chaînes L (Light) - 2 chaînes de 50 kD
Chaînes lourdes
Chaînes H (Heavy)
Déterminants isotypiques
- propres à une classe ou sous-classe d’Ig et sont présents chez tous les individus d’une même espèce.
- définissent des marqueurs sérologiques des régions constantes des chaînes lourdes et légères
Structure des 5 classes d’immunoglobulines sécrétées
valence = 2 : IgD - IgG - IgE
valence = 4 : IgA dimériques
valence = 10 : IgM pentamérique
Déterminants allotypiques
- Variations antigéniques d’une même protéine au sein d’une même espèce
- marqueurs polymorphiques des Ig
Déterminants idiotypiques
Déterminants antigéniques présents sur les domaines variables des Ig
Antigène
Molécule capable d’être reconnue par un anticorps (ou par un TCR, sous forme de peptide antigénique). Les microorganismes présentent de multiples antigènes. Il peut s’agir de molécules isolées, ou de structures complexes ou d’éléments fixés à la surface de micro-organismes pathogènes. Les antigènes peuvent être de nature protéique, oligosaccharidique, lipidique ou encore chimique.
Antigène multivalent
La plupart des antigènes présentent plusieurs épitopes. On parle d’antigènes multivalents; ces épitopes peuvent être différents; c’est le cas par exemple de la plupart des protéines qui présentent plusieurs épitopes. Chacun de ces épitopes peut donc être reconnu par un anticorps différent. En surface des pathogènes, on peut également trouver de nombreuses copies d’un même épitope.
Haptène
molécule en général de faible poids moléculaire incapable de provoquer à elle seule la formation d’anticorps mais pouvant réagir avec un anticorps et devenir immunogénique par couplage avec une protéine porteuse. En général les haptènes présentent un seul épitope et sont de nature non protéique.
Interaction antigène/ anticorps
Forces mises en jeu: liaisons faibles (forces électrostatiques, liaisons hydrogènes, forces de Van der Waals, interactions hydrophobes)
→ Complémentarité structurale
AFFINITE
La constante d’association Ka mesure l’affinité d’UN épitope avec UN paratope
Ag + Ac <=> Ag-Ac
A l’équilibre : 𝐾a = (Ag-Ac)/((Ag)*Ac)
[Ag]= concentration en antigène libre (mol.L-1)
[Ac]: concentration en anticorps libre en (mol.L-1)
10^5L.mol-1 < Ka < 10^10L.mol-1
AVIDITE
L’avidité (ou affinité fonctionnelle) correspond à la force des interactions entre un anticorps multivalent et un antigène multivalent (à épitopes répétitifs)
avantage de la multivalence : constante multivalence/constante d’équilibre monovalence
Anticorps polyclonaux
- définition
- modalité de production
- cellules productrices
- épitopes reconnus
- classe des anticorps
- paratopes
- avantages
- inconvénient
- définition
Mélanges d’AC produits par différents clones de plasmocytes. Ils peuvent reconnaître, sur un même AG, un ou plusieurs épitopes. - modalité de production
Immunisation d’animaux par un AG puis prélèvement du sérum et sélection des AC dirigés contre l’AG d’intérêt - cellules productrices
Multiples clones de plasmocytes - épitopes reconnus
Epitopes multiples sur les AG utilisés pour l’immunisation - classe des anticorps
Mélange d’AC de plusieurs classes - paratopes
Mélange d’ACs présentant des paratopes différents - avantages
Mise en oeuvre rapide de la production - inconvénients
Variabilité entre les sérums
Production de volumes limités
Risque élevé de réactionscroisées
Anticorps monoclonaux
- définition
- modalité de production
- cellules productrices
- épitopes reconnus
- classe des anticorps
- paratopes
- avantages
- inconvénients
- définition
AC tous identiques reconnaissant le même épitope sur un AG donné; ils sont produits par un unique clone de plasmocyte. - modalité de production
Immunisation d’animaux par un AG, prélèvementde la rate, mise en oeuvre de la technique des hybridomes, sélection des clones sécrétant des AC dirigés contre l’AG d’intérêt - cellules productrices
Hybridome issu d’un unique clone de plasmocyte - épitopes reconnus
Epitope unique d’un AG unique - classe des anticorps
Une seule classe - paratopes
AC présentant tous le même paratope - avantages
Solutionhomogène d’AC ayant tous les mêmes propriétés →reproductibilité des expériences
Possibilité de production illimitée des AC (conservation des hybridomes) - inconvénients
Principe de production des anticorps monoclonaux
Technique des hybridomes développée par Kohler et Milstein
(développement de la technique en 1975, obtention du prix Nobel en 1984)
1ère étape: immunisation de souris par l’antigène en présence d’adjuvant complet de Freund. Rappels par l’antigène en présence d’adjuvant incomplet de Freund.
2ème étape: Prélèvement de la rate et récupération des plasmocytes. Fusion entre plasmocytes sécréteurs d’anticorps et cellules myélomateusesne sécrétant pas d’anticorps, en présence de polyéthylène glycol (PEG)
3ème étape: propagation. Les cellules myélomateuses ont perdu (par sélection génique) la faculté de produire l’hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-transférase (HGPRT), impliquée dans la voie de sauvetage de synthèse des nucléotides. L’aminoptérinecontenue dans le milieu HAT (Hypoxanthine, Aminoptérine, Thymidine), bloque la voie de synthèse de novo des nucléotides, forçant les cellules à utiliser la voie de sauvetage; seuls les plasmocytes et les hybridomes survivent; Les lymphocytes B non fusionnés meurent car ils sont dépourvus de la capacité de prolifération.
4ème étape: sélection et clonage
Principe général des techniques utilisant des anticorps
- exploitation de la spécificité et l’affinité de la reconnaissance des antigènes par les anticorps
- de nombreuses techniques utilisant les anticorps utilisent des anticorps marqués : fluorophores, enzymes, isotopes radioactifs, métaux lourds, oligonucléotides
- il existe 2 grands types de marquages : immunomarquages directs et indirects
IMMUNOMARQUAGE DIRECT
Avantages:
Rapidité (une seule étape d’incubation)
Pas de réactivité croisée liée à l’anticorps secondaire
Inconvénients
Nécessité de marquer l’anticorps primaire
Pas d’amplification du signal
IMMUNOMARQUAGE INDIRECT
Avantages:
Amplification du signal (d’autant + importante que l’AC secondaire est polyclonal)
Nombreux anticorps secondaires disponibles (évite de marquer les AC primaires)
Inconvénients
Etape supplémentaire d’incubation
Possibilité de réactivité croisée de l’anticorps secondaire
Anticorps primaire
Anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt
Anticorps secondaire marqué
Anticorps réalisé dans une autre espèce animale que l’anticorps primaire, dirigé contre les déterminants isotypiquesdu fragment Fcdes Igproduites par l’espèce productrice de l’anticorps primaire
Fixation non spécifique des anticorps ?
Nécessité de contrôles dans les expériences utilisant des anticorps
Fixation non spécifique par le paratope(réaction croisée)
Evaluation de cette liaison aspécifique est réalisée à l’aide d’isotypes contrôle. L’objectif d’un contrôle isotypique est de déterminer le niveau de marquage non spécifique aux cellules analysées.
En pratique, on marque les cellules avec un anticorps dit “irrelevant” (non pertinent de la cible d’intérêt contre laquelle l’anticorps d’intérêt est dirigé). Cet anticorps a le même isotype et est couplé au même fluorochrome ou à la même enzyme que l’anticorps d’intérêt.
contrôles de fixation non spécifique en cytométrie de flux
La fluorescence observée peut être en partie non spécifique. Il existe à cela 3 causes possibles:
1. Autofluorescence des cellules
2. Détection non désirée d’un autre fluorophore (en cas notamment de recouvrement partiel des spectres d’émission et d’excitation des fluorochromesutilisés)
3. Fixation non spécifique des marqueurs fluorescents
→ Nécessité de contrôles:
* Mesure du signal des cellules non marquées
* Mesure du signal de cellules d’intérêt avec un anticorps du même isotype mais dirigé contre un antigène absent (↔contrôle isotypique)
+ Nécessité de réglages fins du cytomètre
Différents types d’ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Application: détection et/ou dosage de la présence de protéines, d’anticorps ou d’antigènes, dans un échantillon
Couplage des anticorps à une enzyme catalysant la formation d’un produit coloré soluble
→ mesure de l’absorbance
ELISA Direct
ELISA Indirect
ELISA Sandwich
ELISA par compétition
ELISA Direct
- Avantages
- Disavantages
Avantages
- short protocol : saves times and reagents
- no cross-reactivity from secondary antibody
Disadvantages
- potential hugh background : all proteins in the sample bind to the surface
- no signal amplification
- low flexibility : the primary antibody must be conjugated
ELISA Indirect
- Avantages
- Disavantages
- Avantages
Signal amplification : several secondary antibodies wil bind to the primary antibody
High flexibility : the same secondary antibody may be used for several primary antibodies - Disavantages
Long protocol if compared to direct ELISA
Potental cross-reactivity from secondary antibody
ELISA Sandwich
- Avantages
- Disavantages
- Avantages
High specificity : involves two antibodies detecting different epitopes on the same antigen
Suitable for complex samples
High flexibility and sensitivity : both direct and indirect methods can be used - Disavantages
Demanding design : finding two antibodues against the same target that recognize different epitopes and work well together can be challenging at time
Etapes :
1/ AC adsorbé à la phase solide
Saturation, lavage
2/ Ajout de l’échantillon, tout Ag spécifique se fixe à l’AC
lavage
3/Ajout du 2nd Ac spécifique de l’Ag lié à l’enzyme
lavage
4/Ajout du substrat de l’enzyme ; la concentration en produit coloré est proportionnelle
> > Les test ELISA sandwich pour doser la concentration en antigène d’intérêt
= nécessité d’une gamme étalon
> > Les tests ELISA pour comparer des réponses : une gamme étalon n’est pas nécessaire
ELISA par compétition
- Avantages
- Disavantages
- étapes ?
- représentation des résultats ?
- Avantages
Depends on base ELISA selected
Suitable for small antigens - Disavantages
Depends on base ELISA selected
CONTROLE :
- Ac adsorbé à la phase solide
Saturation, lavage
- Ajout de l’Ag marqué par l’enzyme (concentration saturante)
lavage
- Ajout du substrat de l’enzyme
ESSAI :
- Ac adsorbé à la phase solide
Saturation, lavage
- Ajout de l’Ag marqué par l’enzyme ET l’échantillon (non marqué)
lavage
- Ajout du substrat de l’enzyme
=> L’absorbance est inversement proportionnelle la concentration d’antigène
ELISA par compétition: Représentation des résultats en % d’inhibition
Développement d’un ELISA par compétition pour détecter la séropositivité anti-RVFV (Rift Valley Fever Virus) dans le bétail (vaches):
* Antigène utilisé: protéine N recombinante du virus RVFV (rNp)
* Développement d’un anticorps monoclonal anti-rNpchez la souris (MAB)
* Adsorption sur les plaques ELISA de la rNp
* Incubation en présence du Mab α-rNPen présence ou en absence de sérum d’animaux
Principe de l’ELISPOT
Détermination du % de cellules produisant une molécule d’intérêt
Les anticorps spécifiques d’une cytokine sont fixés sur le fond d’un puits en plastique
Les cellules T activées sont ajoutées au puits. Ces cellules T représentent un mélange de différentes fonctions effectrices.
La cytokine sécrétées par certaines cellules T activées est captée par l’anticorps fixé.
La cytokine captée est révélée par un second anticorps spécifique, couplé à une enzyme ce qui produit un précipité coloré, formant une tache ou spot.
Western-blot (immunoempreinte)
Western-blot:
Méthode de détection et d’identification de protéines présentes dans un échantillon biologique
Comparaison de la quantité de protéines présentes dans 2 échantillons différents (analyse semi-quantitative)
Technique comportant 4 grandes étapes:
1. Séparation électrophorétique des protéines (le plus souvent SDS-PAGE); la migration d’une protéine dépend de sa masse moléculaire
2. Transfert (électrotransfert) des protéines du gel sur une membrane (ex: nitrocellulose, PVDF)
3. Marquage des membranes: saturation, puis incubation en présence d’un anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt puis d’un anticorps secondaire conjugué à un système de révélation
4. Révélation par incubation en présence du substrat
L’électrophorèse en conditions réductrices et dénaturantes (SDS-PAGE : sodium dodécyl-sulfate- Polyacrylamide Gel
Electrophoresis) est la plus utilisée → permet de déterminer la masse moléculaire des protéines
Après électrophorèse, il faut marquer la protéine d’intérêt afin de les visualiser
→ nécessité de transférer les protéines sur une surface permettant le marquage par les anticorps
Protéines chargées négativement migrent vers l’anode sous l’effet d’un champ électrique
Une membrane est incorporée entre le gel et l’anode.
Les protéines adhèrent à la membrane selon leur même disposition sur le gel.
Les membranes peuvent être de nitrocellulose ou de PolyVinyliDene Fluoride (PVFD). Les membranes PCDF requièrent un prétraitement au méthanol.
Contrôles d’un Western-blot
Contrôles positifs
Comparer tout nouvel échantillon à des échantillons connus pour exprimer la protéine d’intérêt
* Protéine recombinante
* Cellules transfectées
* Tissus ou lignées cellulaires qui expriment la protéine
Contrôles négatifs
Inclure également un échantillon qui n’exprime pas la protéine d’intérêt
* Echantillons KO ou ARNsi
* Tissus ou lignées cellulaires n’exprimant pas la protéine
Contrôle de charge
* Contrôles permettant de vérifier que le dépôt de protéine est identique dans chaque puits
* Ce contrôle correspond à la détection d’une protéine hautement conservée et ubiquitaire (présente de manière égale quel que soit le type d’échantillon)
bêta-actine, GAPDH, tubuline, VDCA1/porine, COXIV, Lamine B1, Protéine se fixant à la boîte TATA
Immunoprécipitation
Co-Immunoprécipitation : contrôles ?
Immunoprécipitation: Détection/ enrichissement/ purification de protéines présentes dans des échantillons
complexes
Co-Immunoprécipitation:Méthode d’étude des interactions macromoléculaires
Contrôles possibles de spécificité de la co-IP
Test d’une éventuelle interaction entre Rac1 et les billes et/ou l’anticorps anti-HAet/ ou la protéine A ou G
→Etude d’un lysat ne contenant par la protéine HA-Pak1-PBD
Test d’une éventuelle association dede la protéine avec les billes et/ou la protéine A ou G
→Contrôle billes seules
Test d’une éventuelle interaction entre Rac1 et le fragment Fcde l’anticorps immobilisé et/ou les billes et/ou la protéine A ou G
→Contrôle isotypique (anticorps irrelevantde même isotype)
Autres contrôles
+ contrôles positifs et négatifs
+ si comparaison de la quantité de protéines co-immunoprécipitéesB, il est nécessaire de contrôler le fait qu’on aie bien précipité la même quantité de protéine A
+ WB sur les extraits cellulaires avant immunoprécipitation(input)
Co-Immunoprécipitationet étude des interactions protéines-ADN
Technique de ChIP: Chromatin
Immunoprecipitation
Objectif: Démontrer l’interaction entre une
protéine d’intérêt et une séquence d’ADN
Méthodologie: Immunoprécipitation de la
protéine puis analyse de l’ADN co-précipité
1/ DNA protein cross-linking
2/ Cell lysis and chromatin shearing (sonication or enzyme digestion)
Fragmented chromatin
Immunoprecipitation with specific antibody
Crosslinking reversal and addition of proteinase
DNA purification
Analysis of bound DNA
RNA immunoprecipitation (RIP)
Objectif: Etude des interactions ARN-protéines
Méthodologie: Immunoprécipitationde la protéine puis analyse de l’ARN co-précipité (qRT-PCR, northern-blot, séquençage…)
Immunofluorescence
Application:Détermination de l’expression d’une protéine ou de sa localisation
Immunomarquage direct
Anti-protéine X couplé à un fluorochrome
Immunomarquage indirect
Anti-protéine X
(ex IgG1 de souris)
Anti-anti-CD4
(ex: anti-IgG1 de souris)
Principaux avantages de la technique
Technique rapide et simple
Technique peu coûteuse
Principal inconvénient
Nécessité de perméabilisation et de fixation préalable des cellules →pas d’étude dynamique
EXEMPLE
Anticorps utilisés:
Mouse α-tubuline +α-mouse-Ab_A488
Donkeyα-actine + α-donkey_cy3
Contrôles à inclure:
*Cellules seules: contrôle de l’autofluorescence
*Anticorps secondaires seuls: contrôle de la spécificité du marquage
*Marquages simples [Mouse α-tubuline + α-mouse-Ab_A488] et [Donkeyα-actine + α-donkey_cy3]
*Marquages croisés [Mouse α-tubuline + α-donkey_cy3] et [Donkeyα-actine+ α-mouse-Ab_A488]
+ double marquage
Immunohistochimie
Application: Méthode de révélation in situ de la présence sur couples histologiques ou étalements cytologiques
Marquage des anticorps par une enzyme catalysant la formation d’un produit insoluble; visualisation des coupes en microscopie optique
Protocole
*Fixation de biopsies d’estomac et de poumons dans 10% de paraformaldéhyde puis congélation à -80°C.
*Réalisation de sections de 3 μm d’épaisseur.
*Pré-traitement des coupes par incubation des sections pendant 30 min dans une solution de H2O2.
*Incubation des coupes successivement avec 1) un anticorps anti IL-32 (KU32-09), 2) un anti-IgG1 biotinylé, 3) avec de la streptavidinecouplée à la peroxydase HRP (horse radish peroxydase).
*Après ajout d’un substrat chromogène dont le produit précipite, les coupes ont été colorées à l’hématoxyline (colorant nucléaire) puis observées.
Microscopie électronique à transmission
- Couplage des anticorps à des particules d’or ou d’argent colloïdal
- Permet d’analyse la localisation sub-cellulaire d’une protéine
- Résolution»_space; imagerie par fluorescence
Principal avantage de la technique
Pouvoir de résolution
Principal inconvénient
Technique complexe, longue et coûteuse
Principe du ProximityLigation Assay(PLA)
Proximityligation assay: Etude des interactions protéine-protéine par fluorescence
i)Liaison d’anticorps primaires reconnaissant les 2 protéines d’intérêt; incubation en présence d’anticorps secondaires liés à des sondes oligonucléotidiques→formation d’un ADN circulaire
ii)Hybridation en présence de d’oligonucléotides de connexion
iii)Ajout d’une DNA ligase
iv)Ajout d’une ADN polymérase (ϕ29 DNA polymerase)→amplification par PCR en cercle roulant (rollingcircleamplification, RCA*) →genèse d’ADN simple brin concatémériquecomposé de copies répétées(facteur d’amplification ∼1000 x) en présence de nucléotides fluorescents (ou incubation en présence d’oligonucléotides complémentaires fluorescents)
Avantages :
Facilité technique et rapidité de l’expérience
Visualisation de la localisation de l’interaction
Possibilité d’étiqueter les protéines cibles
Inconvénients :
Utilisation de matériel fixé
Nécessité des anticorps validés en immunohistochimie
Expérience onéreuse
