L’utilisation des anticorps en biotechnologie Flashcards

Question

ELISA Direct - Avantages - Disavantages

Answer 1

Avantages - short protocol : saves times and reagents - no cross-reactivity from secondary antibody Disadvantages - potential hugh background : all proteins in the sample bind to the surface - no signal amplification - low flexibility : the primary antibody must be conjugated

Answer 2

- Avantages Signal amplification : several secondary antibodies wil bind to the primary antibody High flexibility : the same secondary antibody may be used for several primary antibodies - Disavantages Long protocol if compared to direct ELISA Potental cross-reactivity from secondary antibody

Answer 3

- Avantages High specificity : involves two antibodies detecting different epitopes on the same antigen Suitable for complex samples High flexibility and sensitivity : both direct and indirect methods can be used - Disavantages Demanding design : finding two antibodues against the same target that recognize different epitopes and work well together can be challenging at time Etapes : 1/ AC adsorbé à la phase solide Saturation, lavage 2/ Ajout de l'échantillon, tout Ag spécifique se fixe à l'AC lavage 3/Ajout du 2nd Ac spécifique de l'Ag lié à l'enzyme lavage 4/Ajout du substrat de l'enzyme ; la concentration en produit coloré est proportionnelle >> Les test ELISA sandwich pour doser la concentration en antigène d’intérêt = nécessité d’une gamme étalon >> Les tests ELISA pour comparer des réponses : une gamme étalon n’est pas nécessaire

Answer 4

- Avantages Depends on base ELISA selected Suitable for small antigens - Disavantages Depends on base ELISA selected CONTROLE : - Ac adsorbé à la phase solide Saturation, lavage - Ajout de l'Ag marqué par l'enzyme (concentration saturante) lavage - Ajout du substrat de l'enzyme ESSAI : - Ac adsorbé à la phase solide Saturation, lavage - Ajout de l'Ag marqué par l'enzyme ET l'échantillon (non marqué) lavage - Ajout du substrat de l'enzyme => L'absorbance est inversement proportionnelle la concentration d'antigène ELISA par compétition: Représentation des résultats en % d’inhibition Développement d’un ELISA par compétition pour détecter la séropositivité anti-RVFV (Rift Valley Fever Virus) dans le bétail (vaches): * Antigène utilisé: protéine N recombinante du virus RVFV (rNp) * Développement d’un anticorps monoclonal anti-rNpchez la souris (MAB) * Adsorption sur les plaques ELISA de la rNp * Incubation en présence du Mab α-rNPen présence ou en absence de sérum d’animaux

Answer 5

Détermination du % de cellules produisant une molécule d'intérêt Les anticorps spécifiques d'une cytokine sont fixés sur le fond d'un puits en plastique Les cellules T activées sont ajoutées au puits. Ces cellules T représentent un mélange de différentes fonctions effectrices. La cytokine sécrétées par certaines cellules T activées est captée par l'anticorps fixé. La cytokine captée est révélée par un second anticorps spécifique, couplé à une enzyme ce qui produit un précipité coloré, formant une tache ou spot.

Answer 6

Western-blot: Méthode de détection et d’identification de protéines présentes dans un échantillon biologique Comparaison de la quantité de protéines présentes dans 2 échantillons différents (analyse semi-quantitative) Technique comportant 4 grandes étapes: 1. Séparation électrophorétique des protéines (le plus souvent SDS-PAGE); la migration d’une protéine dépend de sa masse moléculaire 2. Transfert (électrotransfert) des protéines du gel sur une membrane (ex: nitrocellulose, PVDF) 3. Marquage des membranes: saturation, puis incubation en présence d’un anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt puis d’un anticorps secondaire conjugué à un système de révélation 4. Révélation par incubation en présence du substrat L’électrophorèse en conditions réductrices et dénaturantes (SDS-PAGE : sodium dodécyl-sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis) est la plus utilisée → permet de déterminer la masse moléculaire des protéines Après électrophorèse, il faut marquer la protéine d’intérêt afin de les visualiser → nécessité de transférer les protéines sur une surface permettant le marquage par les anticorps Protéines chargées négativement migrent vers l'anode sous l'effet d'un champ électrique Une membrane est incorporée entre le gel et l'anode. Les protéines adhèrent à la membrane selon leur même disposition sur le gel. Les membranes peuvent être de nitrocellulose ou de PolyVinyliDene Fluoride (PVFD). Les membranes PCDF requièrent un prétraitement au méthanol.

Answer 7

Contrôles positifs Comparer tout nouvel échantillon à des échantillons connus pour exprimer la protéine d’intérêt * Protéine recombinante * Cellules transfectées * Tissus ou lignées cellulaires qui expriment la protéine Contrôles négatifs Inclure également un échantillon qui n’exprime pas la protéine d’intérêt * Echantillons KO ou ARNsi * Tissus ou lignées cellulaires n’exprimant pas la protéine Contrôle de charge * Contrôles permettant de vérifier que le dépôt de protéine est identique dans chaque puits * Ce contrôle correspond à la détection d’une protéine hautement conservée et ubiquitaire (présente de manière égale quel que soit le type d’échantillon) bêta-actine, GAPDH, tubuline, VDCA1/porine, COXIV, Lamine B1, Protéine se fixant à la boîte TATA

Answer 8

Immunoprécipitation: Détection/ enrichissement/ purification de protéines présentes dans des échantillons complexes Co-Immunoprécipitation:Méthode d’étude des interactions macromoléculaires Contrôles possibles de spécificité de la co-IP Test d’une éventuelle interaction entre Rac1 et les billes et/ou l’anticorps anti-HAet/ ou la protéine A ou G →Etude d’un lysat ne contenant par la protéine HA-Pak1-PBD Test d’une éventuelle association dede la protéine avec les billes et/ou la protéine A ou G →Contrôle billes seules Test d’une éventuelle interaction entre Rac1 et le fragment Fcde l’anticorps immobilisé et/ou les billes et/ou la protéine A ou G →Contrôle isotypique (anticorps irrelevantde même isotype) Autres contrôles + contrôles positifs et négatifs + si comparaison de la quantité de protéines co-immunoprécipitéesB, il est nécessaire de contrôler le fait qu’on aie bien précipité la même quantité de protéine A + WB sur les extraits cellulaires avant immunoprécipitation(input)

Answer 9

Technique de ChIP: Chromatin Immunoprecipitation Objectif: Démontrer l’interaction entre une protéine d’intérêt et une séquence d’ADN Méthodologie: Immunoprécipitation de la protéine puis analyse de l’ADN co-précipité 1/ DNA protein cross-linking 2/ Cell lysis and chromatin shearing (sonication or enzyme digestion) Fragmented chromatin Immunoprecipitation with specific antibody Crosslinking reversal and addition of proteinase DNA purification Analysis of bound DNA

Answer 10

Objectif: Etude des interactions ARN-protéines Méthodologie: Immunoprécipitationde la protéine puis analyse de l’ARN co-précipité (qRT-PCR, northern-blot, séquençage…)

Answer 11

Application:Détermination de l’expression d’une protéine ou de sa localisation Immunomarquage direct Anti-protéine X couplé à un fluorochrome Immunomarquage indirect Anti-protéine X (ex IgG1 de souris) Anti-anti-CD4 (ex: anti-IgG1 de souris) Principaux avantages de la technique Technique rapide et simple Technique peu coûteuse Principal inconvénient Nécessité de perméabilisation et de fixation préalable des cellules →pas d’étude dynamique EXEMPLE Anticorps utilisés: Mouse α-tubuline +α-mouse-Ab_A488 Donkeyα-actine + α-donkey_cy3 Contrôles à inclure: *Cellules seules: contrôle de l’autofluorescence *Anticorps secondaires seuls: contrôle de la spécificité du marquage *Marquages simples [Mouse α-tubuline + α-mouse-Ab_A488] et [Donkeyα-actine + α-donkey_cy3] *Marquages croisés [Mouse α-tubuline + α-donkey_cy3] et [Donkeyα-actine+ α-mouse-Ab_A488] + double marquage

Answer 12

Application: Méthode de révélation in situ de la présence sur couples histologiques ou étalements cytologiques Marquage des anticorps par une enzyme catalysant la formation d’un produit insoluble; visualisation des coupes en microscopie optique Protocole *Fixation de biopsies d’estomac et de poumons dans 10% de paraformaldéhyde puis congélation à -80°C. *Réalisation de sections de 3 μm d’épaisseur. *Pré-traitement des coupes par incubation des sections pendant 30 min dans une solution de H2O2. *Incubation des coupes successivement avec 1) un anticorps anti IL-32 (KU32-09), 2) un anti-IgG1 biotinylé, 3) avec de la streptavidinecouplée à la peroxydase HRP (horse radish peroxydase). *Après ajout d’un substrat chromogène dont le produit précipite, les coupes ont été colorées à l’hématoxyline (colorant nucléaire) puis observées.

Answer 13

* Couplage des anticorps à des particules d’or ou d’argent colloïdal * Permet d’analyse la localisation sub-cellulaire d’une protéine * Résolution >> imagerie par fluorescence Principal avantage de la technique Pouvoir de résolution Principal inconvénient Technique complexe, longue et coûteuse

Answer 14

Proximityligation assay: Etude des interactions protéine-protéine par fluorescence i)Liaison d’anticorps primaires reconnaissant les 2 protéines d’intérêt; incubation en présence d’anticorps secondaires liés à des sondes oligonucléotidiques→formation d’un ADN circulaire ii)Hybridation en présence de d’oligonucléotides de connexion iii)Ajout d’une DNA ligase iv)Ajout d’une ADN polymérase (ϕ29 DNA polymerase)→amplification par PCR en cercle roulant (rollingcircleamplification, RCA*) →genèse d’ADN simple brin concatémériquecomposé de copies répétées(facteur d’amplification ∼1000 x) en présence de nucléotides fluorescents (ou incubation en présence d’oligonucléotides complémentaires fluorescents) Avantages : Facilité technique et rapidité de l'expérience Visualisation de la localisation de l'interaction Possibilité d'étiqueter les protéines cibles Inconvénients : Utilisation de matériel fixé Nécessité des anticorps validés en immunohistochimie Expérience onéreuse