Intra (chap 123) Flashcards
Qu’est-ce qu’une puce à ADN?
c’est une multitude de sondes d’ADN immobilisées sur un support solide et sur lequel on dépose notre échantillon. On marque les ADN ou ARN à hybrider avec un fluorophore De plus en plus remplacé par le séquencage
Quelles sont les techniques de quantification de l’expression des gènes ?
Buvardage northern
PCR et rt-qPCR
Puces à ADN
Séquencage d’ARN
Quelles sont les techniques d’analyse des interactions protéine-protéine ?
Co-IP
FRET
Système du double-hybride
En quoi consiste la dégradation d’Edman ?
C’est un séquençage en N-terminal des protéines de 40 à 50 AA La méthode permet d’enlever et d’identifier séquentiellement les acides aminés en N-tail On commence par purifier la protéine d’intérêt. On fixe ensuite un cycle aromatique (PITC) en N-tail On met on condition acide, ce qui va cycliser le dernier acide aminé en N-tail et il va se détacher. On va analyser quel est l’acide aminé avec la chromatographie
Quels sont les avantages du système du double hybride ?
BEAU BON PAS CHER
in vivo
N’importe quelle protéine de n’importe quel organisme
Pas besoin de protéine purifiée
Criblage de banque
Expliquer le principe de l’empreinte à la DNase ?
Ça sert à déterminer le site de liaison d’une protéine sur l’ADN de manière assez précise. La technique peut se faire in vivo ou in vitro Le fragment d’ADN doit être de séquence connue. l’ADN marqué va être incubé avec une protéine ou un mélange de protéine. La DNase va ensuite être ajouté et dégrader partiellement l’ADN non encombré par une ou des protéines On va ensuite faire migrer sur gel et comparer avec la séquence d’ADN non traitée. On va obtenir un patron correspondant au site de liaison de la protéine.
Pourquoi on ne pourrait pas utiliser Taqman pour faire des courbes de dissociations des réactions dans le rt-qPCR ?
Parce que une fois que la sonde est dégradée, elle va fluorescer, que l’ADN soit double brin ou simple brin. On ne pourrait pas suivre la réaction.
Expliquer la méthode du simple hybride.
Sert à déterminer si une protéine lie une séquence d’ADN particulière in vivo. Le système consiste en une seule fusion, soit la protéine d’intérêt avec la région d’activation d’un activateur de transcription. Les sites de liaison de l’activateur seront remplacés par la séquence voulue. On pourra ainsi déterminer s’il y a une interaction avec la séquence d’ADN
Expliquer le principe de la méthode ChIP-exo
On va faire une empreinte de la protéine à l’aide d’exonucléases qui vont dégrader l’ADN munis d’adaptateurs. L’exonucléase va dégrader àpartir d’un brin et va s’arrêter en arrivant au niveau de la protéine. Le tout sera suivi d’une immunoprécipitation, puis analysé par séquençage haut-débit.
Quelle technique est la plus précise pour analyser des complexes protéine-ADN ?
ChIP-exo, car on arrive directement aux nucléotides liés a la protéine et ils seront séquencés
À quoi sert le PMF (peptide mass fingerprinting) ?
C’est une méthode utilisée pour identifier des protéines en la digérant d’une façon connue (trypsine) et les fragments générés seront suffisamment uniques pour identifier la protéine d’origine. (une digestion est faite en lab et une autre par ordinateur, le tout est comparé)
On veut séquencer un produit de PCR pour un clonage moléculaire. Quelle technologie devrait-on utiliser?
Sanger, car une seule séquence.
On veut savoir si une protéine P est synthétisée dans une cellule cancéreuse. Quelle technique peut-on utiliser?
Western Blot.
Quelles sont les méthodes d’étude des extrémités des transcrits ?
Extension d’amorce 5’-RACE
Quelles sont les méthodes utilisées pour analyser l’ADN suite à une immunoprécipitation de la chromatine ?
qPCR
Séquençage haut débit (ChIP-seq)
Comment est faite l’électrophorèse en 2D ?
1- séparation par le point isoéletrique 2- séparation en fonction du poids moléculaire
On veut analyser le transcriptome en réponse à un stress. Quelle technologie de séquence devrait-on utiliser?
Illumina ou Ion Torrent - on veut séquencer une grande quantité de séquence pour pouvoir quantifier les gènes!
On veut déterminer les positions des promoteurs chez une nouvelle bactérie. Quelle technique peut-on utiliser?
5’-RACE. Puisque la technique d’extension d’amorce ne fonctionne que sur une molécule d’ARN à la fois, et que cette séquence doit être connue, ce serait beaucoup trop long de l’utiliser.
On sait que la protéine P se lie à un certain gène d’intérêt. Quelle technique devrait-on utiliser si on veut déterminer son site de liaison exact sur cet ADN?
- Empreinte à la DNAse - ChIP-exo (beaucoup plus précis)
Pourquoi est-il possible d’analyser les interactions protéines-ADN par ChIP dans différentes conditions?
Parce qu’on fixe au formaldéhyde. Les interactions existantes au moment de la fixation seront celles observées. On pourrait donc faire plusieurs conditions dans lesquelles les cellules vont pousser et analyser les liaisons prot-ADN
En quoi consiste le système du double hybride ?
On cherche a reconstituer la capacité d’activation de la transcription par une interaction entre 2 protéines pour permettre l’expression d’un gène rapporteur
On amplifie par PCR la région qui nous intéresse et on le met dans un plasmide.
On va obtenir la fusion de la protéine et du domaine de liaison, et une autre fusion de l’autre protéine avec le domaine d’activation
À quoi sert d’ajouter un anticorps dans la méthode d’analyse par retardement sur gel ?
L’ajout d’un anticorps va augmenter l’encombrement stérique, donc la migration sera plus lente. Il sert aussi de contrôle de spécificité
Quelles conditions sont importantes pour qu’une co-IP ffonctionne au niveau des protéines ?
La liaison entre les deux doit être suffisamment forte l’épitope de la protéine doit être exposé
En quoi consiste la méthode d’extension d’amorce ?
On fait migrer sur le gel un fragment obtenu à côté d’une réaction de séquencage d’ADN (ressemble à Sanger) avec la même amorce et on détermine le site d’initiation de la transcription. Fonctionne sur une seule molécule d’ARN à la fois. La séquence doit être connue.
À quoi sert le FPKM ?
Puisque les gènes plus long vont générer plus de fragments qu’on gène plus court, on doit normaliser la taille du gène. On compense en disant que chaque gène possède 1 kb de long
Est-ce que l’immunobuvardage Western est une méthode qui permet de quantifier ?
Oui, à condition d’avoir plusieurs contrôles
Quels sont les désavantages du système du double hybride ?
Interactions indirectes
Faux-positifs et faux-négatifs
Problèmes de repliements et stabilité, certaines protéines sont toxiques
Activateurs et répresseurs
La levure ne peut pas faire toutes les modifications post-traductionnelles
Taille limitée des protéines
À quoisert le Stacking gel ?
A mettre les protéines dans la même bande, le plus mince possible afin que le début de la migration dans le separating soit égal pour toutes.
Quel gel est utilisé pour le buvardage northern?
Gel d’agarose dénaturant avec formaldéhyde
Expliquer le principe d’analyse par retardement sur gel
Permet d’analyser des interactions protéine-ADN
On va pouvoir déterminer si un fragment d’ADN peut lier une/des protéines in vitro.
L’ADN est de séquence connue.
On va faire migrer l’ADN et s’il est lié à une protéine, la migration sera plus lente par rapport au fragment seul.
Décrire les caractéristiques du colorant SYBR green
Émet de la fluorescence quand il est attaché à de l’ADN db Non-spécifique Peut être utilisé pour n’importe quel gène, tant qu’on en a un seul par échantillon Pas cher
