Intra (chap 123) Flashcards
Qu’est-ce qu’une puce à ADN?
c’est une multitude de sondes d’ADN immobilisées sur un support solide et sur lequel on dépose notre échantillon. On marque les ADN ou ARN à hybrider avec un fluorophore De plus en plus remplacé par le séquencage
Quelles sont les techniques de quantification de l’expression des gènes ?
Buvardage northern
PCR et rt-qPCR
Puces à ADN
Séquencage d’ARN
Quelles sont les techniques d’analyse des interactions protéine-protéine ?
Co-IP
FRET
Système du double-hybride
En quoi consiste la dégradation d’Edman ?
C’est un séquençage en N-terminal des protéines de 40 à 50 AA La méthode permet d’enlever et d’identifier séquentiellement les acides aminés en N-tail On commence par purifier la protéine d’intérêt. On fixe ensuite un cycle aromatique (PITC) en N-tail On met on condition acide, ce qui va cycliser le dernier acide aminé en N-tail et il va se détacher. On va analyser quel est l’acide aminé avec la chromatographie
Quels sont les avantages du système du double hybride ?
BEAU BON PAS CHER
in vivo
N’importe quelle protéine de n’importe quel organisme
Pas besoin de protéine purifiée
Criblage de banque
Expliquer le principe de l’empreinte à la DNase ?
Ça sert à déterminer le site de liaison d’une protéine sur l’ADN de manière assez précise. La technique peut se faire in vivo ou in vitro Le fragment d’ADN doit être de séquence connue. l’ADN marqué va être incubé avec une protéine ou un mélange de protéine. La DNase va ensuite être ajouté et dégrader partiellement l’ADN non encombré par une ou des protéines On va ensuite faire migrer sur gel et comparer avec la séquence d’ADN non traitée. On va obtenir un patron correspondant au site de liaison de la protéine.
Pourquoi on ne pourrait pas utiliser Taqman pour faire des courbes de dissociations des réactions dans le rt-qPCR ?
Parce que une fois que la sonde est dégradée, elle va fluorescer, que l’ADN soit double brin ou simple brin. On ne pourrait pas suivre la réaction.
Expliquer la méthode du simple hybride.
Sert à déterminer si une protéine lie une séquence d’ADN particulière in vivo. Le système consiste en une seule fusion, soit la protéine d’intérêt avec la région d’activation d’un activateur de transcription. Les sites de liaison de l’activateur seront remplacés par la séquence voulue. On pourra ainsi déterminer s’il y a une interaction avec la séquence d’ADN
Expliquer le principe de la méthode ChIP-exo
On va faire une empreinte de la protéine à l’aide d’exonucléases qui vont dégrader l’ADN munis d’adaptateurs. L’exonucléase va dégrader àpartir d’un brin et va s’arrêter en arrivant au niveau de la protéine. Le tout sera suivi d’une immunoprécipitation, puis analysé par séquençage haut-débit.
Quelle technique est la plus précise pour analyser des complexes protéine-ADN ?
ChIP-exo, car on arrive directement aux nucléotides liés a la protéine et ils seront séquencés
À quoi sert le PMF (peptide mass fingerprinting) ?
C’est une méthode utilisée pour identifier des protéines en la digérant d’une façon connue (trypsine) et les fragments générés seront suffisamment uniques pour identifier la protéine d’origine. (une digestion est faite en lab et une autre par ordinateur, le tout est comparé)
On veut séquencer un produit de PCR pour un clonage moléculaire. Quelle technologie devrait-on utiliser?
Sanger, car une seule séquence.
On veut savoir si une protéine P est synthétisée dans une cellule cancéreuse. Quelle technique peut-on utiliser?
Western Blot.
Quelles sont les méthodes d’étude des extrémités des transcrits ?
Extension d’amorce 5’-RACE
Quelles sont les méthodes utilisées pour analyser l’ADN suite à une immunoprécipitation de la chromatine ?
qPCR
Séquençage haut débit (ChIP-seq)
Comment est faite l’électrophorèse en 2D ?
1- séparation par le point isoéletrique 2- séparation en fonction du poids moléculaire
On veut analyser le transcriptome en réponse à un stress. Quelle technologie de séquence devrait-on utiliser?
Illumina ou Ion Torrent - on veut séquencer une grande quantité de séquence pour pouvoir quantifier les gènes!
On veut déterminer les positions des promoteurs chez une nouvelle bactérie. Quelle technique peut-on utiliser?
5’-RACE. Puisque la technique d’extension d’amorce ne fonctionne que sur une molécule d’ARN à la fois, et que cette séquence doit être connue, ce serait beaucoup trop long de l’utiliser.
On sait que la protéine P se lie à un certain gène d’intérêt. Quelle technique devrait-on utiliser si on veut déterminer son site de liaison exact sur cet ADN?
- Empreinte à la DNAse - ChIP-exo (beaucoup plus précis)
Pourquoi est-il possible d’analyser les interactions protéines-ADN par ChIP dans différentes conditions?
Parce qu’on fixe au formaldéhyde. Les interactions existantes au moment de la fixation seront celles observées. On pourrait donc faire plusieurs conditions dans lesquelles les cellules vont pousser et analyser les liaisons prot-ADN
En quoi consiste le système du double hybride ?
On cherche a reconstituer la capacité d’activation de la transcription par une interaction entre 2 protéines pour permettre l’expression d’un gène rapporteur
On amplifie par PCR la région qui nous intéresse et on le met dans un plasmide.
On va obtenir la fusion de la protéine et du domaine de liaison, et une autre fusion de l’autre protéine avec le domaine d’activation
À quoi sert d’ajouter un anticorps dans la méthode d’analyse par retardement sur gel ?
L’ajout d’un anticorps va augmenter l’encombrement stérique, donc la migration sera plus lente. Il sert aussi de contrôle de spécificité
Quelles conditions sont importantes pour qu’une co-IP ffonctionne au niveau des protéines ?
La liaison entre les deux doit être suffisamment forte l’épitope de la protéine doit être exposé
En quoi consiste la méthode d’extension d’amorce ?
On fait migrer sur le gel un fragment obtenu à côté d’une réaction de séquencage d’ADN (ressemble à Sanger) avec la même amorce et on détermine le site d’initiation de la transcription. Fonctionne sur une seule molécule d’ARN à la fois. La séquence doit être connue.
À quoi sert le FPKM ?
Puisque les gènes plus long vont générer plus de fragments qu’on gène plus court, on doit normaliser la taille du gène. On compense en disant que chaque gène possède 1 kb de long
Est-ce que l’immunobuvardage Western est une méthode qui permet de quantifier ?
Oui, à condition d’avoir plusieurs contrôles
Quels sont les désavantages du système du double hybride ?
Interactions indirectes
Faux-positifs et faux-négatifs
Problèmes de repliements et stabilité, certaines protéines sont toxiques
Activateurs et répresseurs
La levure ne peut pas faire toutes les modifications post-traductionnelles
Taille limitée des protéines
À quoisert le Stacking gel ?
A mettre les protéines dans la même bande, le plus mince possible afin que le début de la migration dans le separating soit égal pour toutes.
Quel gel est utilisé pour le buvardage northern?
Gel d’agarose dénaturant avec formaldéhyde
Expliquer le principe d’analyse par retardement sur gel
Permet d’analyser des interactions protéine-ADN
On va pouvoir déterminer si un fragment d’ADN peut lier une/des protéines in vitro.
L’ADN est de séquence connue.
On va faire migrer l’ADN et s’il est lié à une protéine, la migration sera plus lente par rapport au fragment seul.
Décrire les caractéristiques du colorant SYBR green
Émet de la fluorescence quand il est attaché à de l’ADN db Non-spécifique Peut être utilisé pour n’importe quel gène, tant qu’on en a un seul par échantillon Pas cher
Quels sont les désavantages des puces à ADN?
Signal non-linéaire pour différentes abondances de molécules On doit absolument savoir la séquence de la molécule avant l’expérience
Quels peuvent être les types d’amorces utilisées pour produire de l’ADNc ?
Amorce spécifique au gène d’intérêt
Amorces aléatoires
Amorces poly-dT
Est-ce que le niveau d’expression du gène rapporteur dans le système du double hybride est proportionnel à la force d’interaction ?
Non, parce que puisqu’on a des protéines en fusion, il peut y avoir de mauvaises conformations et on a des modifications post-traductionnelles Ce n’est pas une mesure quantitative directe.
Décrire les caractéristiques d’une sonde Taqman
Dépendante de l’activité 5’-3’ de la polymérase Constituée d’un fluorophore en 5’, de la séquence spécifique de l’amorce et d’un extincteur en 3’ Émet de la fluorescence quand elle est dégradée Permet de quantifier plusieurs amplicons en même temps dans le même tube avec des fluorophores différents
Quel est le principe d’une co-IP ?
IP d’un complexe protéique intact en ciblant une des composantes du complexe afin d’identifier les autres membres
À quoi sert le dosage par spectrophotométrie ?
Connaître la concentration des protéines d’un échantillon, mais ça mesure toutes les protéines, donc ce n’est pas spécifique.
Décrire les conditions d’hybridation utilisées pour les amorces avec le buvardage Northern
La température d’hybridation doit être de Tm-25°C afin d’avoir une hybridation rapide et peu stringente et de conserver des liaisons spécifiques le plus possible
À quoi sert de faire des courbes de dissociations des réactions dans le rt-qPCR et pourquoi on utilise le SYRB green?
Trouver la température a laquelle les molécules d’ADN db se dénaturent pour devenir sb Le SYBR green va perdre de la fluorescence, donc on va perdre le signal quand la molécule va être sb Ça permet aussi de détecter des produits non-spécifiques par l’apparition de pics (dimères d’amorces etc)
On veut identifier des mutations entre un tissu de patient sain VS patient avec tumeur. Quelle technologie de séquençage utiliser?
Illumina - bonne couverture de génome, faible taux d’erreur, peu cher.
Comment fait-on pour quantifier par rt-PCR ? (absolu)
On fait plusieurs dilutions du produit d’intérêt de quantité connue. On va faire plusieurs réactions de PCR avec une sonde pour détecter la quantité . On va obtenir une courbe standard qu’on pourra comparer avec l’échantillon inconnu.
On étudie une séquence d’ADN connue et on se demande si une protéine d’intérêt peut s’y lier in vivo. Quelle technique peut-on utiliser?
- Système simple hybride - Immunoprécipitation de chromatine
Quel est l’avantage et le désavantage de l’électrophorèse en 2D ?
+ : Permet de séparer des centaines de protéines sur le même gel - : Faible reproductibilité, faible résolution pour les PI et poids moléculaire très faibles ou élevés
Quelles sont les produits dans un gel SDS-PAGE pour dénaturer ?
SDS, qui est un détergent qui s’associe aux protéines et leur donne une charge négative Agent réducteur qui défait les ponts disulfure et évite les structures tridimensionnelles.
On a un extrait cellulaire contenant la protéine A et d’autres protéines. On veut savoir si la protéine A forme un complexe avec d’autres protéines présentes, et lesquelles. Quelle technique peut-on utiliser?
Co-immunoprécipitation.
En quoi consiste la méthode de FRET ?
C’est un transfert d’énergie entre 2 molécules fluorescentes et selon leur distance, la fluorescence émise sera plus ou moins forte. Ca permet de savoir la distance entre 2 protéines pour analyser les interactions
On veut quantifier par RT-qPCR l’expression de 4 gènes différents. Quelles méthode de détection serait-il plus avantageux d’utiliser?
Les sondes Taqman, puisqu’on peut quantifier plusieurs amplicons à la fois, en utilisant des fluorophores différents pour leurs différentes sondes. Par contre, très couteux!
Quels sont les contrôles critiques pour le rt-qPCR?
Les étapes d’acquisition, de traitement et d’entreposage des échantillons doivent être adéquates Contrôle de qualité DO260/DO280 et d’intégrité ARNr 28S/18S Quantification de l’ARN extrait Faire une réaction sans ajout de transcriptase inverse (détection d’ADN contaminant) Valider les courbes de dissociation des réactions par SYBR green Validation et optimisation des amorces et conditions de PCR
Quelles sont les techniques d’analyse des protéines ?
Dosage de Bradford Électrophorèse SDS-PAGE en 2 dimension Immunobuvardage western
Quelles sont les étapes de spectrométrie de masse ?
On extrait les protéines On les isole individuellement et on va obtenir des pics. Les protéines vont ensuite être digérées à la trypsine On va déterminer la masse et assembler les résultats
Pourquoi dénaturer les protéines dans un SDS-PAGE ?
Les protéines ont différentes charges nettes , donc la migration se feraient dans tous les sens dans le gel. Le repliement des protéines peut influencer leur migration
Quelles sont les limitations de l’immunoprécipitation de la chromatine ?
interaction non-spécifiques de l’anticorps avec d’autres protéines que celle qui nous intéresse l’épitope peut être caché, donc les anticorps monoclonaux sont un désavantage Une mauvaise sonication peut donner de longs fragments qui pourront se lier à plusieurs protéines. La résolution serait réduite et la précision serait moindre.
Comment et pourquoi retirer les ARNr d’un échantillon à analyser ?
Parce que les ARNm qu’on veut analyser font seulement 2% du mélange On peut enrichir les ARNm polyadénylés (MICROExpress) On peut faire une déplétion des ARNr par hybridation soustractive (Ribo zero) Ou faire une déplétion d’ARNr par nucléase spécifique aux molécules db (méthode DSN)
À quoi sert le buvardage Northern?
Ca permet de quantifier et de déterminer la taille d’une molécule d’ARN en les séparant par électrophorèse
On étudie une séquence d’ADN connue et on se demande si une protéine d’intérêt peut s’y lier in vitro. Quelle technique peut-on utiliser?
Retardement sur gel.
En quoi consiste la méthode 5’-RACE ?
Repose sur la ligation d’un court adaptateur d’ARN de séquence connue aux extrémités d’une molécule d’ARN. On utilise ensuite une amorce d’ADN de séquence connue pour RT. Des amorces correspondant à l’adaptateur d’ARN et à l’amorce RT sont utilisées pour une amplification PCR On séquence les produits de PCR en utilisant la séquence de l’adaptateur d’ARN RACE va amplifier seulement le début de la molécule
À quoi peut être due une migration aberrante dans un SDS-PAGE ?
Modifications post-traductionnelles (P, glycosylation) Charge très significative de la protéine
En quoi consiste la fragmentation de peptide-ions par collision ?
Le peptide se fait bombarder d’ions d’hélium et les fragments obtenus vont produire un spectre et on pourra assembler la protéine.
Quelles sont les techniques d’analyse des interactions protéine-ADN ?
Retardement sur gel Empreinte à la DNase Simple-hybride ChIP-Seq + ChIP-exo
Qu’est-ce que la méthode TAP (tandem affinity purification) ?
C’est une co-IP in vivo qui permet d’analyser des interactions prot-prot impliquant la création d’une protéine de fusion avec l’étiquette TAP
Que contient l’étiquette TAP ?
Protéine A pour la liaison à des billes avec des IgG Site de clivage d’une protéase pour libérer les protéines immobilisées sur les billes Calmoduline pour lier des billes avec des atomes de Ca
Quelles techniques peut-on utiliser si on veut quantifier l’expression d’un gène d’intéret?
- Buvardage Northern - RT-qPCR - Puces à ADN - RNA-seq
Quel est le principe du dose de Bradford?
On utilise le Bleu de Coomassie. Ce dernier va se lier aux acides aminés basiques et aromatiques La DO est prise à 595 nm pour savoir s’il est lié à des acides aminés
Quelles sont les techniques de séquençage des protéines?
Dégradation d’Edman Spectrométrie de masse
On croit qu’il y aurait des acétylations au niveau des histones pour les gène A, B et C chez un patient. Quelle technique peut-on utiliser pour valider notre hypothèse?
Immunoprécipitation de chromatine avec anticorps spécifique pour histones acétylées + qPCR avec amorces pour les gènes d’intérêts A, B et C.
Qu’est-ce que la trypsine ?
Protéase qui clive après les résidus lysine ou en ctail d’une arginine
Quel est l’avantage d’utiliser des amorces poly-dT pour produire de l’ADNc?
On va pouvoir transcrire l’ARN au complet
Quelles sont les principales étapes pour le séquencage de l’ARN ?
Fragmentation de l’ARN Ajout d’une amorce aléatoire et polymérisation dégradation du fragment d’ARN Ajout d’un brin avec des U Ligation d’adaptateurs Dégradation du brin avec U PCR avec l’ADNc Alignement sur génome de référence
Quel serait l’impact sur un rt-qPCR si on laisse l’échantillon sur le comptoir trop longtemps ?
Le nombre de molécules dégradé augmenterait. Les molécules intactes seraient en minorité et le temps pour atteindre le seuil et apercevoir les produits serait beaucoup plus long
On veut déterminer sur quels gènes on retrouve des marques de méthylation de l’histone 3 chez un patient malade. Quelle technique doit-on utiliser?
Immunoprécipitation de chromatine + séquençage (ChIP-seq), avec anticorps spécifiques pour l’histone 3 méthylée.
Comment fait-on pour valider et optimiser les amorces et les conditions de PCR ?
Vérifier la spécificité des amorces et la taille des produits obtenus en les mettant sur gel Éviter les produits non-spécifiques en vérifiant par SYBR green afin de ne pas affecter l’efficacité de la réaction
Quelles sont les méthodes de détection par fluorescence ?
Colorant SYBR green Sondes Taqman
Pourquoi l’étiquette TAP possède les prot A et de la calmoduline ?
Ca va consister en deux étapes de purification afin d’obtenir un produit final plus pur
En quoi consiste la spectrométrie de masse ?
C’est une méthode qui mesure la masse de protéines et de peptides avec une très grande précision et on pourra faire un lien avec une banque de données
Expliquer le principe de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
Sert à savoir si une protéine lie un fragment d’ADN in vivo. On peut arriver à trouver tous les sites de liaison d’une protéine sur un génome. Les échantillons sont fixés au formaldéhyde L’ADN est fragmenté par sonication. Un anticorps spécifique se liant à la protéine va être utilisé pour immunoprécipiter les complexe ADN-protéine L’ADN va être récupéré et sera quantifié
Est-ce qu’une protéine co-IP avec une autre signifie qu’il y a un complexe ?
Pas nécessairement, elles peuvent faire partie d’un réseau de protéines qui interagissent ensemble à différents moments pour accomplir différentes fonctions
Quelles sont les techniques d’analyse des interactions protéine-ADN ?
Retardement sur gel Empreinte à la DNase Simple-hybride ChIP-Seq + ChIP-exo
Comment fait-on pour quantifier par rt-PCR ? (relatif)
On prend un gène de référence et on le teste dans 2 conditions en s’assurant que la quantité ne va pas être affectée. On va pouvoir quantifier la variation du gène cible par rapport au gène de référence afin de savoir dans quelle condition il est exprimé le plus. On doit regarder la différence entre les 2 écarts
