Final Flashcards
En quoi consiste shRNA ?
C’est le Short hairpin RNA.
Ce sont des ARN adoptant une structure en tige et boucle pouvant être impliqués dans le phénomène d’interférence par ARN. Ils sont exprimés dans la cellule à l’aide de vecteurs viraux ou plasmides.
Le complexe Dicer va se lier à cet ARN db pour le cliver en plusieurs morceaux.
Ces fragments db vont recruter le complexe RISC, qui va dégrader le brin sens de l’ARN db.
Avec le brin anti-sens, le complexe RISC va sonder les ARNm cellulaires et couper tous ceux avec une séquence complémentaire.
L’ARNm va être dégradé et la protéine ne sera pas produite
= extinction de l’expression du gène
Décrire l’assemblage par recombinaison in vivo
On utilise la levure S. cerevisiae qui est capable de faire de la recombinaison homologue avec de grands fragments avec des régions d’homologie qui vont s’échanger
On peut utiliser des fragments qui se chevauchent de 40-80 nt de long
On utilise une souche de levure qui est incapable de pousser sur son milieu si elle n’a pas de fragment d’ADN recombiné (gène de sélection, comme Histidine).
Capacité d’assemblage de nombreux fragments de très grandes tailles (Gibson a démontré 25 fragment de 25kbp), mais long car la levure ne pousse pas vite
Quel genre de plasmide doit être utilisé pour avoir une transfection stable ?
On doit utiliser des plasmides viraux pour avoir la meilleur efficacité possible.
L’ADN pourra être mieux intégré au génome cellulaire.
Le choix du virus est fait selon le type cellulaire utilisé.
Quels sont les avantages de l’assemblage de Guibson ?
Ne nécessite aucune enzyme de restriction
Pas de cicatrice (séquence d’ADN restante des étapes précédentes)
Tous les produits de PCR s’assemblent en même temps dans une seule réaction
Dans le mécanisme de transfection à l’aide d’une particule d’encapsidation (lignée cellulaire spécialisée), expliquer comment on s’assure que le virus ne pourra pas se répliquer
La particule d’encapsidation porte à l’intérieur les enzymes nécessaires à l’encapsidation du virus et la reverse transcriptase. Le virus sera donc reverse-transcrit afin de pouvoir s’intégrer dans le génome de la cellule hôte avec le gène d’intérêt qui a été cloné à l’intérieur.
Or, dans cette séquence, les protéines de réplication du génome et les protéines de structures sont absentes.
Le virus n’arrivera pas à se répliquer.
Les protéines qu’il avait transporté avec lui dans la capside n’étaient utilisables qu’une fois.
Décrire le mécanisme de transfection par liposome
Le liposome est constitué d’une tête cahrgée + et de 2 chaines d’acide gras.
Les acides gras vont se regrouper et former des micelles, exposant les tête + vers l’extérieur.
Cest têtes + vont pouvoir former des complexes avec l’ADN -, qui seront endocytés à l’intérieur de la cellule, puis fusionnés avec le noyau.
Que peut-on obtenir avec un Tm trop bas lors d’un PCR ?
des hybridations non-spécifiques ou des structures secondaires non-désirées
- hybridation entre amorces
- mauvaise hybridation des amorces avec l’ADN, donc produits de mauvaise taille
- Formation de structures secondaires
Comment fait-on une souris KO ?
On design le gène à muter à l’intérieur des 2 séquences homologues pour faire la recombinaison homologue. On peut prendre par ex un gène de résistance à un antibiotique.
On a également la séquence TK, qui est un marqueur de contre-sélection pour les cellules ayant mal fait la recombinaison dans le vecteur.
On va transfecter des cellules souches avec le vecteur. .
Les cellules ayant bien fait la recombinaison homologue n’auront pas le gène TK et auront le gène de résistance à l’antibiotique de sélection.
On va récupérer le génome d’une cellule et l’incorporer dans le blastocyte d’une femelle souris.
Le souriceau obtenu sera mutant (normalement pour un seul allèle)
Dans quel cas il ne faut pas prendre le bon pH associé à une polymérase X ?
Si on veut faire de la mutagénèse aléatoire.
Le mauvais pH va entrainer plus d’erreurs de synthèse du brin d’ADN par la polymérase.
Quelles sont les techniques de mutagénèse dirigée ?
– Mutagénèse dirigée par PCR
– Recombineering
– Endonucléases programmées
Quelles sont les stratégies d’optimisation du PCR ?
Optimisation de la température de renaturation du PCR
changement du tampon (pH, ions Mg2+, additifs [DMSO, betaine, formamide, détergents, BSA, etc.])
Utilisation d’une autre ADN pol
Design et synthèse de nouvelles amorces
En quoi consiste la recombinaison homologue dans un organisme ?
On a un fragment d’ADN produit par PCR ou mutagénèse, qui va contenir un gène d’intérêt ou de sélection. Les régions d’homologie vont pouvoir aller faire une recombinaison. On va donc échanger les fragments.
On insère généralement un marqueur de résistance, permettant la sélection des mutants.
Utilisé principalement chez la levure
Qu’est-ce qu’une interruption de gène ?
Ce sont toutes les stratégies qui permettent de surexprimer ou de réprimer un gène.
L’analyse du phénotype qu’engendrent ces modifications devrait permettre d’accéder à la (ou les) fonction(s) du gène.
Décrire TALEN
Correspond un domaine de liaison à l’ADN constitué de répétitions de 33 ou 34 acides-aminés identiques à l’exception des acides aminés 12 et 13 (reconnaissance d’un nucléotide).
On eut donc assembler plusieurs de ces motifs pour reconnaître une séquence spécifique.
On le couple à FokI, qui doit être dimérisé, donc on met un assemblage de TALEN de part et d’autre du gène à modifier.
Quelles sont les2 familles d’ADN pol thermophiles utilisées pour l’amplification ?
Famille A : proviennent de bactéries, pas d’activité de correction. Ex : Taq
Famille B : proviennent d’archéees, activité de correction. Ex : Pfu et KOD
À quoi sert la polymérase du bactériophage Phi29 ?
Elle sert à faire une amplification isothermale par déplacement de brins. (méthode du cercle roulant)
La réaction se déroule toujours à 30C.
Cette enzyme ne décroche par de son brin matrice, donc il est possible de faire de très longs fragments (10-100 kpb).
Elle ne dégrade pas non plus le brin en avant d’elle (activité exonucléase), mais elle le tasse pour ‘‘passer en dessous’’. De nouvelles amorces pourront s’hybrider aux séquences ‘‘tassées’’ et ça va avoir un effet exponentiel d’amplification.
Quelles caractéristiques doivent avoir une amorce ?
Longueur de 20-30 nt
Éviter des amorces qui forment des structures secondaires stables ou des dimères
Les 2 amorces doivent avoir un Tm semblable (+/- 5°C)
Pas de phosphorylation en 5’
Que choisir entre Zn fingers et TALEN ?
TALEN est plus petit et la coupure st plus spécifique.
CRSPR reste le meilleur…
Quelle partie de l’amorce doit absolument être hybridée à la matrice d’ADN ? pourquoi ?
La partie en 3’ doit absolument être hybridée, car elle permettra d’amorcer la synthèse du nouveau brin.
L’extrémité 5’ peut être flottante, donc on peut s’en servir pour ajouter une séquence, comme le site de restriction d’une enzyme pour faire du clonage ou un tag pour la purification de la protéine.
Quel système est utilisé pour les systèmes inductibles de gènes et en quoi il consiste ?
Le système Cre-Lox
La Cre est une recombinase qui catalyse la recombinaison entre deux site de reconnaissance, les sites LoxP.
LoxP est une séquence d’ADN de 34 pb comprenant aux extrémités 13 nucléotides palindromiques (il est donc impossible de trouver cette séquence dans un génome eucaryote). Les deux sites peuvent être très éloignés l’un de l’autre et être quand même recombinés par la Cre.
2 LoxP qui se regardent seront inversées par Cre
2 LoxP orientés dans la même direction verront la séquence à l’intérieur retirée par Cre (formation d’un épisome)
L’expression de Cre est induite et peut être seulement dans un tissu
Comment fait-on la synthèse d’un brin d’ADN qui n’existe pas dans la nature ?
À partir d’oligonucléotides (40-75pb) ayant des régions de chevauchement avec les oligonucléotides qui les bordent. Les premiers cycles de PCR créent de courts fragments qui s’assemblent progressivement.
Les amorces externes sont en large excès par rapport aux autres, ce qui, plus le PCR progresse, promeut la synthèse de fragments complets
Comment faire pour ajouter une séquence Sur des fragments d’ADN clonés dans un
plasmide ou amplifiés par PCR ?
Ajout : créer une amorce qui va contenir le court ajout de nt et qui pourra s’hybrider sur le brin matrice, et une autre amorce en sens inverse
Les amorces de la PCR contiennent les bases modifiées: lors de la phase de polymérisation élongation), les mutations sont incorporées dans le nouvel amplicon.
Qu’est-ce qui arrive avec un Tm trop élevé ?
Les produits seront très spécifiques, mais on diminue l’efficacité
En quoi consiste le RNA interférence (siRNA) ?
On ajoute dans la cellule un ARN double brin, qui va être reconnu comme une menace par la cellule.
Le complexe Dicer va se lier à cet ARN db pour le cliver en plusieurs morceaux.
Ces fragments db vont recruter le complexe RISC, qui va dégrader le brin sens de l’ARN db.
Avec le brin anti-sens, le complexe RISC va sonder les ARNm cellulaires et couper tous ceux avec une séquence complémentaire.
L’ARNm va être dégradé et la protéine ne sera pas produite
= extinction de l’expression du gène
Quelles sont les caractéristiques des plasmides utilisées pour analyser l’expression eucaryote ?
plasmides caractérises par présence de promoteurs adaptés:
- d‘origine virale: CMV, SV40
- d‘origine eucaryote: eIF1, actine
Le problème est plutôt la transfection du plasmide dans la cellule eucaryote
Comment sélectionner les mutants eucaryotes stables ?
On met un gène de sélection eucaryote, comme les bactéries.
On pourra ainsi sélectionner les clones ayant intégré l’épisome à leur ADN
Que doit contenir un plasmide de clonage moléculaire ?
Origine de réplication
Site de clonage multiple
Marqueur de sélection
