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Grundlagen Der Gentechnik Flashcards

1
Q

Grundlegendes Klonierungsexperiment

A
  • Plasmidvector+ zu klonierendes DNA Fragment, das enzymatisch in den Vektor eingefügt wird
  • > zB Antibiotikaresistenz in e.coli
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Q

Welche Enzymarten spielen in der Gentechnik eine Rolle?

A
  1. Nukleasen
  2. Modifizierende Enzyme
  3. Polymerasen
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3
Q

Nukleasen

A

Restriktionsendonukleasen

Nukleasen

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4
Q

Modifizierende Enzyme

A

Ligasen

Phosphatesasen/ Kinasen/ Transferasen

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5
Q

Polymerasen

A

Dna
RNA
Reverse Transkriptasen

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6
Q

DNA Aufbau (Enden!)

A

5ˋ -P

3ˋ OH

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7
Q

Restriktionsendonukleasen

A
  • DNA-restringierende Systeme bei Phageninfektion von Bakterien
  • bestehen aus Nuklease- und Methylase-Aktivität
  • sind methylierungsabhängig
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8
Q

Restriktionsendonukleasen Typ 1

A
  • komplexe Nukleasen; Methylase und
    Nuklease
  • benötigen ATP, MG2+und S-Adenosylmethionin
  • spezifische 15 bp Bindungsstelle
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9
Q

Restriktionsendonukleasen Typ 2

A
  • brauchen Mg2+
  • palindromische Erkennungssequenz, meist 4-8bp
  • Bindungs- und Schnittstelle identisch
  • hydrolytische Spaltung
  • spezifische Puffer-Anforderungen
  • Anwendungen: Restriktionskarten, Klonierung, Southern-Blot, RFLP Analyse
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10
Q

Restriktionsendonuklease Typ 3

A
  • braucht ATP & Mg2+
  • nicht-palindromische Erkennungssequenz
  • schneidet ca 5-15 bp entfernt
  • bildet distinktiv Fragmente
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11
Q

Sticky ends, Blunt ends

A
  • sticky ends bilden einzelsträngige DNA Enden (Sequenz kommt auf Enzym an) -> spezifische Basenpaarung nötig
  • glatte Enden können beliebig kombiniert bzw ligiert werde
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12
Q

Isoschizomere

A

Gleiche Erkennungssequenz, schneiden gleich

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13
Q

Neoschizomere

A

Gleiche Erkennungssequenz, schneiden unterschiedlich

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14
Q

Methylierungspaare

A

Enzyme mit gleicher Erkennungssequenz, aber unterschiedlicher Methylierungsabhängigkeit

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15
Q

Wie wird die Aktivität von Restriktionsenzymen gemessen?

A

Eine Einheit eines Restriktionsenzyms ist die Menge Enzym, die 1 Mikrogramm DNA des Phagen Lamda in einer Stunde in speziellem Puffer bei 37° vollständig verdaut.
-> Zahl der Schnittstellen unterschiedlich

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16
Q

Wie pipettiere ich einen Restriktionsverdau?

A 
X mikrol h2o
2 Mikro l 10fach Puffer
X mi. L- DNA 
(x mi. L BSA)
0.x mi.l Enzym
=20 Mikro l Vol gesamt
17
Q

Nukleasen (Phosphodiesterasen)

A

Spalten Phosphodiesterbindungen innerhalb von Nukleinsäuren

18
Q

Endonukleasen

A

Spalten beliebig innerhalb einer Nukleinsäure

19
Q

Exonuklease

A

Spalten vom Ende einzelne. Ukleotide ab

20
Q 
Nuklease SI (Endonuklease)
Aspergillus oryzae
A
  • einzelsträngige DNA und RNA Endonukleaseaktivität
  • ‚transcript mapping‘; glätten von DNA-Enden; generieren von ‚Nicks‘ in Doppels. DNA, Spalten von Hairpin-Strukturen
  • Zn2+ und pH 4,5
21
Q 
DNase 1 (Endonuklease)
B. Taunus
A
  • 1- und 2-strängige DNA-Endonuklease, auch in RNA/DNA Hybriden
  • Degradation von DNA aus RNA-Proben, ‚DNase 1 footprinting‘ zum Proteine schützen, ‚Nick‘-Translation
  • Mg2+ für random nicks in Anwesenheit von Mn2+ wird beidseitig geschnitten _> blunt ends
22
Q

T4-DNA-Ligase

Bacteriophage T4

A
  • verknüpft 5´-Phosphatende mit 3´-OH Gruppe zweier DNA Stränge (Oder DNA+ doppelsträngige RNA oder zwei doppelsträngige RNAs)
  • Ligation von DNA Enden, Veknüpfung von Bruchstellen (nicks) in DNA
  • Mg2+, ATP
23
Q

T4-RNA-Ligasen

Bacteriophage T4: Single Strand ligase

A
  • Ligation einzelsträngiger Nukleinsäuren
  • radioaktive 3´ Markierung von RNA
  • ATP
24
Q

Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP aus B. taurus)

-Phophatase-

A
  • hydrolysiert die 5´ p Gruppe aus DNA, RNA, rNTPs, dNTPs
  • dephosphorylierung von Vektorenden, um die Religationsrate zu reduzieren
  • alkalischer pH, Mg2+
25
T4-Polynucleotid-Kinase (PNK, T4 Baceteriophage) | -Kinase-
- überträgt das Gamma-Phosphat von ATP auf das 5‘-Ende von Nukleotiden - Phosphorylierung von PCR-Produktem - 5‘-End Markierung von DNA, RNA oder Oligonukleotiden - Mg2+, ATP, reduzierendes Milieu
26
``` Terminale Desoxynucleotidyltransferase (B. Taurus) - Transferasen) ```
- hängt Nukleotide an freie 3‘-OH Gruppe - Homopolymerschwänze, die dadurch an DNA gekoppelt werden), 3‘-End Markierung von DNA - Mg2+, dNTPs
27
DNA-Polymerasen 1 | Holoenzym (E. Coli)
- DNA-abhängige DNA-Polymerasen - 3‘-Exonuklease (für 1. und 2. strängig) - 5‘ Exonuklease für doppelsträngige DNA - Auffüllen von 5‘-Überhängen, entfernen von 3‘-Überhängen, Markierungen - Mg2+, Primer, dNTPs
28
``` DNA-Polymerasen 1 Klenow Fragment (E. Coli) ```
- entspricht DNA-Poly. 1, aber ohne 5‘ Exonukleaseaktivität - auffüllen von 5‘-Überhängen, entfernen von 3‘-Überhängen; radioaktive Sequenzierung, cDNA-Synthese (Zweitstrang) - Mg2+, Primer, dNTPs
29
T4-DNA-Polymerase
- DNA-abhängige DNA-Polymerase, 3‘ Exonuclesse - auffüllen von 5‘-Überhängen, bevorzugt fürs entfernen von 3‘-Überhängen verwendet durch hohe Exonuklease-Aktivität - Mg2+, Primer, dNTPSs
30
Thermostabile DNA-Polymerasen
- DNA-abhängige DNA-polymerasen - tolerant ggü. hohen Temperaturen besonders geeignet für PCR-Reaktionen, ortsspezifische Mutagenese, Sequenzierungen etc. - Mg2+, dNTPs, Primer
31
Reverse Transriptasen - > MMLV R. T. (Moloney Murine Leukemia Virus) - > AMV R. t. ( Avian Myeloblastosis Virus)
- RNA- abhängige DNA_polymerase - gibt es auch ohne Rnase H - Erststrangsynthese von cDNA - Degradierung von RNA in RNA/DNA Hybriden - braucht Mg2+, Primer
32
Was sind die Schlüsselpunkte?
- DNA-modifizierende Enzyme sind Grundlage aller molekular-biologischen Techniken - alle verwendeten Enzyme leiten sich aus elementaren biol. Prozessen ab - erfordern spez. Reaktionsbedingungen, die eingehalten werden müssen - durch Veränderungen der Enzyme können Eigenschaften angepasst werden
33
Wofür ist die Nuklease-Aktivität und wofür die Methylase-Aktivität der Restriktionsendonukleasen?
- Nuklease: zum Spalten des Zucker-Phosphats der Nukleinsäuren - Methylase: für die Methylierung der Erkennungssequenu
34
Was macht eine Ligase?
Verknüpft das 5‘Phosphatende mit der 3‘-OH Gruppe von 2 DNA Strängen
35
Was ist das Klenow-Fragment?
Teil der DNA-Polymerase 1 von E. Coli, es keine 5‘-Exonukleaseaktivität hat
36
Mit welchem Stoff wird DNA sichtbar gemacht?
Ethidiumbromid

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