Gentekniker och genreglering (föreläsning 6,8,9)

Question 1

Vad är PCR (polymerase chain reaction) och hur funkar det steg för steg?

Answer 1

PCR är en reaktion som används för att amplifiera en DNA sekvens, alltså öka mängden DNA av just den sekvens man vill titta närmare på.

1. Denaturering: Temperaturen höjs till mellan 92 - 95°C. DNA helixen öppnas upp och DNA:t blir enkelsträngat.
2. Annealing: Temperaturen sänks till mellan 45 - 65°C
   Detta gör det möjligt för primers att binda till det enkelsträngade DNA:t.
3. Elongering: Temperaturen höjs till mellan 65 - 75°C, oftast till 72°C. DNA-polymeraset binder till primers och börjar DNA syntesen genom att sätta in en nukleotid och fortsätter med insättning i 5’-3’ riktning.

Kedjereaktion: Allt ny-syntetiserat DNA används som templat i nästa cykel, totalt ca 30 cyklar.

Question 2

Vad behövs för att en PCR reaktion ska kunna ske?

Answer 2

Det dubbelsträngade DNAt som ska amplifieras
DNA polymeras
Mg2+ (viktig co-faktor för DNA-polymeras)
De fyra deoxyribonukleosid-trifosfaterna (A, T, G, C)
Buffert
Vatten

Man behöver också veta något om DNA sekvensen som ska amplifieras för att kunna tillverka nästa sak som behövs:
två oligonukleotid primers (korta, ca 20 nukleotider långa, enkelsträngade DNA sekvenser, en på 5’ änden och en på 3’ änden.

Question 3

Varför är PCR metoden så extremt viktig inom molekylärbiologisk forskning?

Answer 3

För att med denna metod kan man studera DNA som man initialt bara har väldigt små mängder av.

Question 4

Vad är gel elektrofores?

Answer 4

Gel elektrofores är en metod man använder för att studera storleken på DNA molekyler genom att låta molekyler vandra genom en elektriskt laddad gel.

Question 5

Hur fungerar elektrofores?

Answer 5

Innan man kan genomföra elektrofores behöver man förbereda en agarosgel som innehåller fluorescerande färg som märker DNA:t i provet. Man förbereder också provet med en laddningsbuffert som gör att man ser vad man gör när provet laddas i gel-brunnarna.
När gelbrunnarna är laddade sätter man igång med elektroforesen, som startar en elektrisk spänning genom gelen. Eftersom DNA är negativt laddat (pga kvävebaserna) så rör sig DNA molekylerna mot den positiva polen. Stora molekyler rör sig långsammare genom gelen och små rör sig snabbt, så efter en tid kan man se band i gelen, där varje band innehåller molekyler av samma storlek. Dessa band jämförs med en kontrolltrappa i gelen som innehåller molekyler av kända storlekar i UV ljus, och på så sätt får man reda på storleken av molekylerna i provet.

Question 6

Nämn tre olika typer av PCR.

Answer 6

1. Kvantitativ PCR (quantitative PCR, qPCR): för att ta reda på mängden DNA i ett visst prov (ex. hur många av en viss plasmid per E. coli cell)
2. Reverse transcription PCR (RT-PCR): för att amplifiera stora mängder DNA från en RNA-sekvens. Första steget = omvänd transkription (RNA-templat àkomplementär DNA-sträng = cDNA). Därefter vanlig PCR.
3. Kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR): ta reda på mängden RNA i ett visst prov. – T.ex. vid test för RNA-virus som SARS-CoV-2.

Question 7

Vad innebär omvänd transkription (reverse transcription) och hur funkar det?

Answer 7

Omvänd transkription innebär att man syntetiserar DNA sekvenser baserat på en mRNA sekvens, vilket kan vara fördelaktigt eftersom man då har färdigprocessat mRNA och inte massa icke-kodande sekvenser (introner).

Det fungerar genom att man adderar “reverse transcriptase” till provet som syntetiserar en DNA sträng från mRNA sekvensen. Sedan löser man upp delar av mRNAt och använder DNA-pol-1 för att fylla i luckorna och ligas för att ligera segmenten. Detta kan sedan användas i en vanlig PCR reaktion för att amplifieras.

Question 8

Ge några exempel på användningsområden för DNA sekvensering.

Answer 8

Exempel:

• Ta reda på om ett kloningsförsök lyckats
• Undersöka om det finns mutationer i en viss gen i en organism
• Ta reda på hela DNA-sekvensen för en människa (helgenom(re)sekvensering)
• Ta reda på hela DNA-sekvensen hos en organism som inte tidigare sekvenserats (de novo helgenomsekvensering)
• Undersöka vilka organismer som finns i ett visst prov (metagenomik)

Question 9

Vad är Sanger-sekvensering?

Answer 9

En metod som används för att få reda på den exakta sekvensen av ett DNA prov.

Question 10

Vad behövs för att utföra Sanger-sekvensering?

Answer 10

DNA-templat: behöver homogent prov med många kopior av samma DNA
1 kort oligonukleotid (primer) Deoxyribonukleotider (dNTPs)
Fluorescent märkta dideoxy- nukleotider (ddNTPs)
DNA-polymeras
Mg2+
Buffert (stabilt pH, salter etc.)
H2O

Question 11

Hur fungerar Sanger-sekvensering?

Answer 11

I en Sanger-sekvensering så är ddNTP:er centrala, detta för att avsaknaden av en OH-grupp på 3’-kolet gör att inga fler nukleotider kan sättas in i kedjan efter att en ddNTP satts in. DNA kedjor syntetiseras efter primern och olika långa kedjor bildas efter att ddNTPer har fäst till kedjan på olika positioner. När en tid har gått och skevenseringen är klar, gör man en separation av DNA-fragment av olika längd i kapillärgel. Eftersom ddNTP:erna har kodats med olika färger, kan man med hjälp av en kromatograf sedan få ut en sekvens från de kortaste till de längsta DNA segmenten och på så sätt få fram själva sekvensen, nukleotid för nukleotid.

Question 12

Vad är Next Generation Sequenceing (NGS) och vilka fördelar har det jämfört med Sanger-sekvensering?

Answer 12

NGS är den mest moderna formen av DNA sekvensering vi har idag. Fördelen med NGS är att det inte kräver ett homogent prov, vilket gör att PCR/kloning inte behövs göras innan sekvenseringen, och att man kan sekvensera flera olika DNA sekvenser samtidigt.

Question 13

Ange några av de vanligaste NGS metoderna.

Answer 13

Illumina, PacBio, Nanopore, Iontorrent

Question 14

Hur fungerar Illuminas NGS i stora drag?

Answer 14

1. DNA-fragment sprids ut över yta
2. Amplifiering i kluster (med PCR)
3. fyra olika fluoroforer (färger) för de olika baserna
4. Kamera detekterar fluorescens från en nukleotid i taget
5. Korta sekvenser (100-150 nt) men många!

Question 15

Hur fungerar PacBios NGS i stora drag?

Answer 15

1. Immobiliserat DNA polymeras (sitter fast i botten på brunn
2. En DNA-molekyl åker ner per brunn
3. Kamera detekterar fluorescens från nukleotid som håller på att inkorporeras
4. Fyra olika fluoroforer (färger)
   Ingen amplifiering behövs! single molecule detection - Långa sekvenser (många kb) men färre än Illumina

Question 16

Vad innebär genreglering och varför är det så viktigt för både individuella celler och multicellulära celler?

Answer 16

Genreglering innebär att uttrycket av olika gener regleras, detta för att det behövs tex mer/mindre av en genprodukt. Detta är så viktigt dels för att lägga resurserna på rätt sak vid rätt tillfälle, hade varit väldigt dyrt energimässigt annars. För flercelliga organismer med specialiserade celler är det viktigt att kunna anpassa vilka gener som uttrycks för att få rätt funktion i rätt del av kroppen. Uttryck av fel gener i en del av kroppen kan leda till tumörer eller celldöd.

Question 17

Vilka är de tre generella sätten som genreglering kan ske på?

Answer 17

På gen-nivå, mRNA nivå och protein nivå.

Question 18

Vad innebär konstitutivt genuttryck?

Answer 18

Att genen uttrycks hela tiden –> leder till att genprodukt produceras kontinuerligt.

Question 19

Genuttryck kan utsättas för induktion eller repression, vad innebär detta?

Answer 19

Induktion innebär att genuttrycket ökar.

Repression innebär att genuttrycket minskar.

Question 20

Förklara vad en inducer och en repressor är.

Answer 20

En inducer(are) är en faktor som ökar genuttrycket.
En repressor är en faktor som minskar genuttrycket.

Question 21

Vad innebär det när genuttrycket är under positiv vs negativ kontroll? Ge ett exempel på vardera.

Answer 21

positiv kontroll innebär att genuttrycket endast sker om det “sätts på” av en regleringsfaktor.
negativ kontroll innebär att genuttrycket behöver stängas av för att inte ske.

Lac-operonet är under negativ kontroll som hävs av laktos.

Trp-operonet är under negativ kontroll som hävs av tryptofan.

Question 22

Vad är ett operon?

Answer 22

Kluster av gener som kodar för genprodukter med liknande eller relaterade funktioner, och som har samma regleringsregioner ligger ofta nära varandra i genomet. Dessa kluster tillsammans med tillhörande regleringssekvenser (som tex promotorn) kallas för operon.

Question 23

Vad är en promoter?

Answer 23

Sekvens på DNA som visar vart transkription ska börja, startpunkten för transkription.

Question 24

Vad är en operator och åt vilket håll om promotorn ligger den?

Answer 24

Operatorn är den plats på DNA strängen (i operonet) som regulatoriska protein kan binda till.

Question 25

Vad innebär allosterisk reglering (repression/aktivering)? Ge ett exempel.

Answer 25

Allosterisk reglering (repression/aktivering)innebär att en regleringsfaktor kan binda till ett reglerande protein och ändra formen på det och på så sätt repressa eller inducera genuttrycket. Ett exempel på detta är Allolaktos som binder till LacI proteinet och ändrar dess form så att det inte kan binda till operatorn, och på så sätt induceras genuttrycket –> allosterisk repression

Question 26

Vad är IPTG och vad används det till?

Answer 26

IPTG är en analog till allolaktos (som bildas när laktos finns) men som är mycket stabilare. Det används ofta när man använder lac-operonet i olika experiment.

Question 27

Vad innebär katabolit-repression? Ge ett exempel.

Answer 27

Katabolit-repression innebär att genuttrycket av enzymer som ingår i katabolismen av en kolkälla repressas när en mer fördelaktig kolkälla finns i omgivningen. Ett exempel på detta är att CAP/cAMP komplexet inhiberas (i Lac operonet) om Glukos finns tillgängligt i mediet.

Question 28

Förklara hur lac-operonet hos E. coli ser ut och vilka faktorer som reglerar det.

Answer 28

lac-operonet består av en promoter, en operator och tre gener: lacY, lacZ och lacA. Två faktorer reglerar lac-operonet, dels repressorgenen lacI som ligger uppströms om lac-operonet och kodar för proteinet LacI som uttrycks konstitutivt och binder till operatorn, vilket leder till att generna i operonet inte uttrycks. Detta innebär att lac-operonet är under negativ kontroll. Den andra regleringsfaktorn är CAP/cAMP komplexet som binder till promotorn och rekryterar RNA polymeras, detta behövs för att transkription av lac-op ska ske.

Question 29

Hur påverkar en stor tillgång till laktos men ingen glukos uttrycket av lac-operonet?

Answer 29

I detta fall kommer laktosen i mediet att binda till Lacl proteinet och ändra dess form så att det inte kan binda till operatorn. När detta sker kommer RNA polymeraset att ta sig framåt som det ska och transkription av lac operonet kommer att ske.

Question 30

Hur påverkar en stor tillgång till glukos men ingen laktos uttrycket av lac-operonet?

Answer 30

Närvaron av glukos kommer att leda till att inget cAMP finns tillgängligt och därför kommer inte CAP kunna binda till promotorn och rekrytera RNA pol, detta leder till ingen transkription av lac-operonet sker.

Question 31

Hur ser trp-operonet hos E. coli ut?

Answer 31

trp-operonet innefattar en promotorsekvens, en operator och fem gener som kodar för aminosyran tryptofan. Uppströms om trp operonet ligger trpR genen som kodar för repressorproteinet TrpR.

Question 32

Hur regleras trp-operonet och när uttrycks generna i operonet?

Answer 32

trp-operonet är dels under reglering av repressorproteinet TrpR, som kodas för av genen trpR som ligger uppströms om operonet. Genen trpR uttrycks konstitutivt men repressorn TrpR kan inte binda till operatorn själv så genern i operonet uttrycks om inget stoppar det. operonet är under negativ kontroll. När tryptofan finns närvarande binder det till repressorn som då ändrar form (allosterisk effekt) och kan då binda till operatorn och på så sätt inhibera uttrycket av generna.

trp-operonet uttrycks när tryptofan är frånvarande.

Question 33

Regleringen av trp-operonet är inte 100% komplett endast med TrpR repressorn, så viss transkription sker ändå vid närvaro av tryptofan. Det finns en ytterligare mekanism som hjälper till att reglera uttrycket av trp-operonet, vad kallas denna och hur fungerar det?

Answer 33

Den andra regleringsfaktorn kallas transkriptionsattenuering (“dämpning”) och innebär att RNAt som bildas vid transkription kan få en sekundär struktur som kan stoppa eller fortsätta transkriptionen av operonets gener.

Question 34

Hur fungerar transkriptionsattenuering?

Answer 34

Efter promotorn och operatorn men innan själva generna i operonet ligger en sekvens “leader” där olika segment kan baspara till varandra i olika kombinationer, och en av dessa är en attenuator-sekvens. Om halten tryptofan är hög i mediet kommer segmenten i “leadern” att baspara på ett sätt så att en “stem-loop” struktur bildas, och denna gör så att RNA strängen släpper och transkriptionen avslutas innan generna transkriberas. Om halten tryptofan istället är låg i mediet, så kommer segmenten i “leadern” att baspara på ett sätt som gör att transkription kan fortgå.

Question 35

Även icke kodande RNA kan reglera uttryck, vad kallas detta och hur funkar det?

Answer 35

Reglering med icke kodande RNA kallas för “Riboswitches” och detta fungerar så här: 5’-UTR (UnTranslated Region) i mRNA innehåller en riboswitch, som är en sekvens på mRNA som kan binda till olika små molekyler; ligander som då ändrar formen på RNAt och då tillåter eller terminerar transkriptionen eller translationen.

Question 36

Vad är antisens-RNA och hur funkar det?

Answer 36

RNA som kan baspara till ett mål-RNA (fullständigt eller delvis) och detta leder till hämning: genom att tex binda till shine-delgarno sekvens och på så sätt hindra translation, eller aktivering av translation: tex genom att binda till något som stoppar translation och på så sätt möjliggöra translation.

Question 37

Eukaryot genreglering är mer komplex än prokaryot (även om prokaryot genreglering är väldigt förenklad facklitteratur), vilka fem generella skillnader finns mellan eukaryot och prokaryot genreglering?

Answer 37

1: Euk. har kärna med hårt packat i kromatin (DNA + histoner) vilket utnyttjas i genregleringen genom att packa det som inte ska uttryckas hårdare och det som ska uttryckas lösare.
2: För prok. sker hänger translation och transkription ihop (i cytoplasman) medan för euk. är transkription och translation separerade både rumsligt och tidsmässigt.
3: Eukaryot mRNA behöver processas innan translation, vilket gör att processen av capping, polyadenylering eller splicing kan regleras för att ändra genuttryck.
4. Prokaryot mRNA är kortlivat medan eukaryot mRNA är mer stabilt, vilket gör att de kan transporteras till olika subdelar av cellen för translation och på så sätt ändra uttryck.
5. Eukaryoter har mycket mer avancerade post-transkriptionella protein-modifieringsmekanismer än prokaryoter.

Question 38

När en eukaryot cell är i interfas ligger inte kromatinet huller om buller som spagetti utan är prydligt uppdelat i så kallade kromosomterritorier. Vart återfinns delar av kromosomen som är transkriptionellt aktiva vs inaktiva?

Answer 38

I utkanten av kromosomterritorierna hittar man transkriptionellt aktiva delar, och i mitten är de transkriptionellt inaktiva delarna.

Question 39

Ange de fyra olika typerna av kromatin-modifiering, beskriv dem kort och ange vilka konsekvenser de generellt får.

Answer 39

1. Förändring av histonkomposition: Att en histon byts ut mot en annan, vilket ändrar egenskaper hos nukleosomerna. Detta gör oftast DNAt mer tillgängligt - underlättar transkription.
2. Histonmodifiering: Histoner har N-terminala svansar som sticker ut från nukleosomen och dessa kan modifieras genom att ett enzym rekryterar proteiner med olika funktioner, tex acetyl (acetylering), fosfat (fosforylering) eller metyl (metylering). Dessa modifieringar är reversibla och kan därför både öka och sänka transkription.
3. Förflyttning av nukleosomer med kromatinremodeleringskomplex. Stora multi-subunit enzymer som flyttar eller tar bort histonkomplex för att göra kromatin mer tillgängligt. Centralt i Epigenetiken!
4. DNA-metylering: Att en metylgrupp klämmer sig in i DNA strängen i regioner med mycket C-G par (CpG-öar) och detta tror man minskar transkription genom att metyleringen stoppar transkriptionsfaktorer från att binda till DNAt. Detta går hand i hand med histonmodifieringar då metylerat DNA rekryterar saker som repressar genuttryck, tex Histon-deacetylas (HDAC).

Question 40

Histonmodifieringar är reversibla, förklara kort hur Histonmodifiering genom acetylering fungerar och namnge viktiga enzymer i processen.

Answer 40

Acetylering innebär att en acetylgrupp läggs till på en histon och denna reaktion katalyseras av histon-acetyltransferas (HAT) vid närvaro av specifika gen-aktiveringsproteiner. Vid närvaro av gen-repressorproteiner kan histone-deacetylas (HDAC) ta bort acetylgrupper från histonsvansen.

Question 41

Vilka två subkategorier ingår i eukaryota promotorer?

Answer 41

Core promoters: visar transkriptions start site och i vilken riktning transkriptionen ska ske

proximal promoter elements: ligger ca 250 nukleotider uppströms om core promotern och fungerar förstärkande för transkription.

Question 42

Cancer cells often have abnormal patterns of chromatin modifications. In some cancers, the DNA repair genes MLH1 and BRCA1 are hypermethylated on their promoter regions. Explain how this abnormal methylation pattern could contribute to cancer.

Answer 42

Hypermetylering hämmar genuttryck, och eftersom det i detta fall är DNA reparationsgenerna som hämmas, kan DNAt inte repareras i den utsträckning det borde, vilket leder till fler mutationer på kort tid vilket kan leda till cancer.

Question 43

Eukaryota core promotorer är nukleotidsekvenser i direkt anslutning till den gen de reglerar. Vilka olika typer av promotorer finns och vad är deras roller i transkriptions-regleringen?

Answer 43

Fokuserad promoter – specificerar transkriptionsstart ifrån en enda stark startsekvens (vanligt för strikt reglerade gener).

Dispergerad (spridd) promoter - specificerar transkriptionsstart ifrån flera svagare sekvenser inom en ca 50-100 nukleotider lång region (vanligt för konstitutivt uttryckta gener).

Question 44

Vilka är de två centrala elementen (sekvenser) i en core promoter och vad gör de?

Answer 44

Initiator och TATA-boxen. Båda initierar transkription var för sig men kan också finnas i samma core promoter.

Question 45

Vilka två cis-agerande element krävs för full

reglerbarhet av eukaryota promotorer? Vad gör dem? Vart finns dem?

Answer 45

Enhancers och silencers. Enhancers är bindningsplatsen för aktivator och silencer är bindningsplatsen för repressor. Dessa kan finnas uppströms, nedströms, långt ifrån eller i genen och fungerar i båda riktningar. Enhancers och silencers reglerar ofta tid- och utvecklingspecifika gener.

Question 46

Vad innebär transkriptionsfaktorer? Vilka är de två viktiga eukaryota transkriptionsfaktorerna (förutom general transcription factors (GTFs))

Answer 46

Transkriptionsfaktorer är trans-agerande faktorer som binder till cis-agerande promotorer. Aktivator binder till ”Enhancers” och repressor binder till ”silencers”.

Question 47

Ge två exempel på post-

transkriptionell reglering.

Answer 47

• Alternativ splicing
• Reglering av mRNA-stabilitet
• RNA-interferens: Reglering med hjälp av små RNA-molekyler (mini- eller mikro RNA)
• Lokal translation
• Aktivering/deaktivering/degradering av färdigt protein

Question 48

Vad innebär alternativ splicing?

Answer 48

Alternativ splicing är splicing där inte bara introner klipps bort, utan öven exoner. Detta ger möjlighet till flera olika mRNAn från varje gen.

Question 49

Hur fungerar reglering av mRNA stabilitet?

Answer 49

mRNA stabiliseras av 5’cap och poly-A svans, utan dessa blir mRNAt känsligt för nedbrytning av exoribonukleaser. Deadenylering innebär att poly-A svansen tas bort och decapping innebär att 5’cap tas bort, båda resuterar i att mRNAt bryts ner (vi vet inte vad som triggar detta ännu)

Question 50

Vad innebär RNA interferens? (RNAi)/mikroRNA

Answer 50

Små RNA (20-25 nt) basparar till mRNA vilket leder till mRNA-degradering och/eller translationen hindras på olika sätt.

Två huvudklasser: mikroRNA (miRNA) och small interfering RNA (siRNA)

Stor del (30-70 %) av våra gener regleras av små RNA