GE: section 5

Question 1

Quels sont les 3 principales étapes de l’isolation de l’ADN ou de l’ARN?

Answer 1

1. Lyse des tissus/cellules
2. Extraction & purification de l’ADN ou ARN
3. Concentrer par sédimentation l’ADN ou l’ARN
4. Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN ou de l’ARN

Question 2

Que retrouve-t-on dans un tampon chaotropique? Quel est la fonction de chacun de ces constituants?

Answer 2

SDS: Lyse membranes
NaOH: reformer les ponts H de l’ADN (précipitation)
Protéinase K

Question 3

Comment puis-je quantifier de l’ADN ou de l’ARN?

Answer 3

Grâce au principe d’absorbance des acides nucléiques, on peut mesurer la DO de l’échantillon à une longueur d’onde de 260nm et utiliser la relation entre la DO et la concentration de l’ADN ou de l’ARN pour quantifier l’ADN/ARN.

Question 4

• À quelle longueur d’onde s’effectue une lecture pour estimer la concentration d’acides nucléiques dans un échantillon?

Answer 4

À 260 nm (longueur d’onde à laquelle l’absorbance est maximale pour les acides nucléiques)

Question 5

Lors de la quantification d’acides nucléiques, qu’est-ce que le ratio 260/280 signifie ?

Answer 5

260nm = longueur d’onde optimale pour l’absorbance des acides nucléiques
280nm = longueur d’onde optimale pour l’absorbance des acides aminées composant les protéines

Si le ratio 260/280 est en dehors des valeurs normales (pour l’ADN ou pour l’ARN), cela indique que l’échantillon est contaminé par des protéines.

Question 6

Quelle est la mesure à prendre pour vérifier la qualité (ou l’intégrité) de l’ARN suite à son isolation à partir de l’extraction d’un tissu ?

Answer 6

Le ratio DO à 260nm/DO à 280nm (anormal si < 1.6)

Question 7

Définir le principe de l’électrophorèse.

Answer 7

La séparation par électrophorèse sur gel permet de séparer des segments par poids moléculaires. Les segments chargés migrent vers l’électrode qui est chargée inversement du segment (ex: électrode positive = l’anode pour les acides nucléiques) dans le gel, et les plus petits segments migrent plus loin que les plus gros. Une échelle moléculaire permet de mesurer la migration et d’estimer le poids moléculaire de l’ADN ou de l’ARN particulier. On peut aussi utiliser cette technique afin de visualiser la qualité de l’échantillon à l’étude.

Question 8

• Pourquoi fait-on varier la porosité des gels d’électrophorèse utilisés lors de l’analyse des échantillons d’ADN ou d’ARN?

Answer 8

Pour mieux laisser passer des fragments de petite taille et retarder ceux de grande taille. On peut ainsi séparer des fragments de taille différente.

Question 9

Quel est le rôle du bromure d’éthidium?

Answer 9

Permet de visualiser les fragments d’ADN dans le gel en s’intercalant entre les acides nucléiques. Le BrEt s’étant intercalé entre des molécules d’ADN est fluorescent lorsqu’excité par des rayons UV.

Question 10

Qu’est-ce qu’une sonde (probe) et quelle est l’utilité d’une sonde d’acide nucléique?

Answer 10

Les sondes nucléotidiques sont des segments d’acides nucléotiques (simple brin) que l’on utilise pour repérer un fragment d’acide nucléique complémentaire (à la sonde) spécifique lors d’une réaction d’hybridation.

Question 11

Sur quelle base les sondes nucléotidiques fonctionnent-elles?

Answer 11

Ce sont des brins d’ADN simple, complémentaires et antiparallèles par rapport à l’ADN recherché. Elles peuvent s’hybrider avec l’ensemble ou une partie de l’ADN à reconnaître et sont repérables (ex: marquage radioactif interne ou externe)

Question 12

Quels sont les 2 paramètres physiques les plus importants qui définissent la réaction d’hybridation entre une sonde et sa cible (les deux étant composés d’ADN)?

Answer 12

température & force ionique

Question 13

Définir ce que l’on entend par une analyse Southern.

Answer 13

L’analyse Southern consiste en le transfert d’ADN sur une membrane à partir du gel de migration (réplique précise de leur migration sur le gel), pour permettre aux fragments de devenir accessibles à une sonde.

Question 14

Définir le principe de la détection par autoradiographie, par colorimétrie ou par fluorescence.

Answer 14

Autoradiographie: Les molécules d’ADN ou d’ARN marquées radioactivement (P32 ou P33) ou celles qui sont hybridées à une sonde marquée radioactivement peuvent être détecter (à l’aide d’une émulsion d’argent) par exposition à un film autoradiographe.

Colorimétrie: Sondes nucléotides sont couplées à la digoxygénine (reconnu grâce à un anticorps) ou à la biotine (reconnu grâce à l’avidine).
La phosphatase alcaline se fixe à l’anitcorps ou l’avidine, transforme un substrat incolore en un précipité violacé pour permettre la localisation de l’hybridation.

Fluorescence: Sondes  nucléotides sont couplées à la digoxygénine (reconnu grâce à un anticorps) ou à la biotine (reconnu grâce à l’avidine).
Un anticorps (marqué à la fluorescence) est dirigé contre l’anticorps (anti-digoxygénine) ou l’avidine. UV  excitation, fluorescence  localisation du complexe d’hybridation.

Question 15

Définir ce que signifie hybridation in situ, pourquoi utilise-t-on cette technique ?

Answer 15

L’hybridation in situ consiste à déterminer les cellules d’un tissu accumulant une population donnée de ARNm sur coupes histologiques.

On peut utiliser cette technique pour localiser un gène sur le chromosome en performant la réaction d’hybridation sur un étalement de chromosomes en métaphase.

Question 16

Nommez et expliquez les différentes étapes essentielles à un cycle de PCR.

Answer 16

1. Dénaturation (température élevée, séparation des 2 brins)
2. hybridation des amorces sur le segment d’ADN simple brin complémentaire
3. élongation du brin copie (par la TAQ polymérase)

Question 17

Nommez 2 caractéristiques que possède l’ADN polymérase utilisée dans la réaction de PCR.

Answer 17

1. résistante à la dénaturation

2. Capable de résister à des températures élevées (95-100)

Question 18

Nommez au moins 3 paramètres qui définissent le choix des amorces utilisées dans la réaction de PCR.

Answer 18

1. longueur de 18 à 24 nucléotides
2. Contenu en G-C 50%
3. Tm entre 64-74 degrés C
4. 2 amorces qui ne peuvent pas s’hybrider l’une à l’autre

Question 19

À quoi sert le hot start (5 min à 95 degré) au début d’un PCR?

Answer 19

Dénaturer l’ADN double brin pour en obtenir des simples brin.

Question 20

Qu’arrivera-t-il si les amorces ont des séquences complémentaires?

Answer 20

Elles pourront s’hybrider ensemble et générer des dimères d’amorce.

Question 21

Pour quelles raisons l’amplification par PCR atteint un plateau après un certain nombre de cycles?

Answer 21

Plateau apport de dNTP(nucléotides) épuisé.

Question 22

Quels sont les avantages d’utiliser la PCR? (3)

Answer 22

Rapide
Sensible
Faible coût

Question 23

Quels sont les désavantages d’utiliser la PCR? (3)

Answer 23

On doit connaitre la séquence à amplifier
Doit être optimisé pour chaque réaction
Contamination possible (amplification de produits non désirés)

Question 24

Peut-on évaluer la quantité d’un ARNm lorsque l’on regarde le produit amplifié par PCR (après 40 cycles)?

Answer 24

Non

Question 25

Quelle technique puis-je utiliser afin de remédier à cette situation?

Answer 25

qPCR

Question 26

Quels sont les deux avantages principaux du qPCR par rapport au PCR traditionnel?

Answer 26

Plus rapide

Peut être utilisé pour évaluer qté (grâce à un agent intercalant) à chaque cycle

Question 27

Quelle molécule permet de suivre l’amplification à chaque cycle d’un qPCR ?

Answer 27

Agent intercalant fluorescent (SYBR green)

Question 28

Dans la technique de qPCR (PCR quantitatif, PCR en temps réel) à quoi sert la courbe de dissociation (melting curve)?

Answer 28

Pour évaluer si l’échantillon est contaminé. i.e. vérifier qu’il n’y a qu’un seuil produit amplifié.

Question 29

Lorsque la melting curve est effectuée à la fin d’une réaction de qPCR. Je m’attends à voir combien de pics? Que signifie l’apparition d’un pic à une très faible température?

Answer 29

Un seul pic (un seul amplicon). Pic à très faible température signifie un petit fragment, qui correspond à un dimer d’amorce (2 amorces se sont hybridées) qui a été amplifié.

Question 30

Quel est l’utilité de gènes comme Rpl19, Gapdh, Hsp90 ou Ldha pour l’évaluation de l’expression de notre gène d’intérêt?

Answer 30

Les housekeeping genes servent de gène de référence et sont utiles pour comparer deux échantillons et évaluer si la différence que l’on observe est réelle, ou si elle est due à une erreur technique.

Question 31

Définir housekeeping gene (gène de ménage).

Answer 31

Gène dont l’expression n’est pas modifiée peu importe le traitement.

Question 32

Par qPCR, Quelles est la technique principalement utilisée pour quantifier les ARN complémentaires provenant de deux populations de cellules?

Answer 32

qPCR avec une courbe standard et housekeeping gene.

Question 33

Par qPCR, Quelles est la technique principalement utilisée pour connaitre la concentration de l’ADN viral dans un tissu infecté.

Answer 33

Courbe standard

Question 34

Quel est l’avantage d’utiliser des analyses d’expression comme les puces à ADN ou le séquençage de nouvelle génération plutôt que la RT-PCR/qPCR?

Answer 34

Il y a plusieurs milliers de DNA chips par lame, ce qui permet une analyse simultanée de beaucoup de gènes.

Question 35

Qu’est ce qu’un didéoxyribose? Quel est son rôle lors du séquençage?

Answer 35

C’est le sucre pentose présent dans le didéoxynucléotide. Structure comme le désoxyribose , mais sans le OH au C3.

Empêche la formation d’une liaison phosphodiester 5-3 entre le sucre et le phosphate du prochain nucléotide et donc arrête l’élongation du segment «copie» du brin à amplifier.

Question 36

Est-il vrai de dire que lors de la réaction de séquençage d’un fragment d’ADN, la réaction effectuée permet de générer tous les fragments possibles d’ADN qui diffèrent l’un de l’autre par seulement 1 nucléotide ?

Answer 36

oui

Question 37

Pour permettre d’initier une réaction de séquençage par l’ADN polymérase,

a) pourquoi est-il nécessaire d’avoir une amorce ?
b) Dans quelle région du fragment de l’ADN à séquencer allez vous choisir cette amorce ?

Answer 37

a) Car l’enzyme ADN polymérase a besoin d’une amorce à laquelle elle peut attacher le prochain nucléotide. Elle catalyse la formation de la liaison phosphodiester 5-3, elle peut donc seulement rajouter un dNTP au brin, elle ne peut pas le débuter.
b) au debut du fragment à séquencer

Question 38

Comment l’électrophorèse sur capillaire a amélioré cette technique?

Answer 38

L’électrophorèse sur capillaire permet d’analyser les produits du séquençage sans avoir à fabriquer un gel à chaque réaction de séquençage.

Question 39

Définir mutation autosomale dominante et autosomale récessive?

Answer 39

Autosomale dominante: Seulement 1 allèle de modifiée = maladie exprimée
Autosomale récessive: Doit avoir les 2 allèles mutées pour exprimer la maladie.

Question 40

Lors d’une mutation de type autosomale récessive, on dit que l’animal hétérozygote est porteur de la mutation. Définir porteur.

Answer 40

Porteur signifie que l’animal à une de ses deux allèles qui cause la maladie, mais cette dernière n’est pas exprimée puisqu’elle est récessive.

Question 41

Comment pourrais-je comparer l’ADN d’un suspect d’un crime à l’ADN retrouvé sur le lieu du crime?

Answer 41

En effectuant une digestion de l’ADN et en comparant les profils de coupure par des enzymes de restriction d’une molécule d’ADN à une autre sur un gel de migration (ex: mère-fille).

Question 42

Comment nomme-t-on un changement d’un nucléotide à une position spécifique lorsque l’on compare la séquence d’un même fragment d’ADN entre 2 individus? Quelle est l’abréviation utilisée?

Answer 42

Single nucleotide polymorphism

SNP («snip»)

Question 43

Comment les SNPs sont-ils utilisés dans l’industrie laitière?

Answer 43

Ils servent à calculer la Direct Genomic Value (DGV), puisqu’on a établi des corrélations entre certains SNP et des caractéristiques de la vache (ex: quantité de gras dans le lait)

Question 44

• Nommez un avantage et un désavantage de la technique de fabrication de souris transgéniques par injection.

Answer 44

Avantage: Très facile à réaliser

Désavantage: l’intégration du transgène se fait de façon aléatoire dans le génome.

Question 45

• Nommez un avantage et un désavantage de la technique de fabrication de souris transgéniques par injection d’un vecteur viral.

Answer 45

Avantage: peut être utilisé chez l’animal adulte

Désavantage: déclenche une réaction immunitaire chez l’animal

Question 46

• Dans la technique de microinjection, que se passera-t-il si le transgène s’intègre au niveau de l’hétérochromatine?

Answer 46

Le transgène ne sera pas exprimé, puisque l’hétérochromatine est compacté, ce qui empêche l’expression du gène.

Question 47

• Dans une souris KO, pourquoi la première génération de souris est mosaïque?

Answer 47

Parce que pour produire la souris KO, on injecte des cellules ES modifiées (gène inactivé) dans le blastocyste, et ces cellules s’intègrent à l’ensemble de cellules à partir duquel toutes les futures cellules de l’organisme vont être différenciées.

À la naissance, les tissus se sont formés avec des cellules différenciées, certains à partir de cellules «normales» et certains à partir de cellules ES modifiées.

Question 48

• Quelle enzyme est utilisée lors de la fabrication de souris knock-out conditionnel spécifique au tissu afin de permettre la recombinaison? Si je veux cibler les cellules d’un tissu X, quel promoteur devrais-je choisir pour contrôler l’expression de cet enzyme?

Answer 48

L’enzyme CRE (reconnait séquence palindromique; activité topoisomérase/recombinase) placée devant un promoteur spécifique à un type cellulaire

Question 49

• Comment puis-je générer un modèle de souris qui inactivera l’expression d’un gène à la fois dans un tissu précis et à un moment précis?

Answer 49

Système Tet-On

Question 50

Nommez les deux modes de réparation de l’ADN pouvant intervenir lors de la fabrication de souris par la méthode CRISPR/Cas9

Answer 50

1. Recombinaison homologue (nécessite un dédoublement de l’ADN)
2. Recombinaison d’extrémités non-homologues.

Question 51

• Quel serait le plus grand avantage à utiliser des cellules souches spermatogoniales (SSCs) plutôt que des cellules ES afin de générer des souris KO?

Answer 51

Ce sont des cellules souches d’une cellule germinale alors elles seront transmises aux générations futures (i.e. héritables).