GE: section 5 Flashcards
Quels sont les 3 principales étapes de l’isolation de l’ADN ou de l’ARN?
- Lyse des tissus/cellules
- Extraction & purification de l’ADN ou ARN
- Concentrer par sédimentation l’ADN ou l’ARN
- Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ADN ou de l’ARN
Que retrouve-t-on dans un tampon chaotropique? Quel est la fonction de chacun de ces constituants?
SDS: Lyse membranes
NaOH: reformer les ponts H de l’ADN (précipitation)
Protéinase K
Comment puis-je quantifier de l’ADN ou de l’ARN?
Grâce au principe d’absorbance des acides nucléiques, on peut mesurer la DO de l’échantillon à une longueur d’onde de 260nm et utiliser la relation entre la DO et la concentration de l’ADN ou de l’ARN pour quantifier l’ADN/ARN.
- À quelle longueur d’onde s’effectue une lecture pour estimer la concentration d’acides nucléiques dans un échantillon?
À 260 nm (longueur d’onde à laquelle l’absorbance est maximale pour les acides nucléiques)
Lors de la quantification d’acides nucléiques, qu’est-ce que le ratio 260/280 signifie ?
260nm = longueur d’onde optimale pour l’absorbance des acides nucléiques 280nm = longueur d’onde optimale pour l’absorbance des acides aminées composant les protéines
Si le ratio 260/280 est en dehors des valeurs normales (pour l’ADN ou pour l’ARN), cela indique que l’échantillon est contaminé par des protéines.
Quelle est la mesure à prendre pour vérifier la qualité (ou l’intégrité) de l’ARN suite à son isolation à partir de l’extraction d’un tissu ?
Le ratio DO à 260nm/DO à 280nm (anormal si < 1.6)
Définir le principe de l’électrophorèse.
La séparation par électrophorèse sur gel permet de séparer des segments par poids moléculaires. Les segments chargés migrent vers l’électrode qui est chargée inversement du segment (ex: électrode positive = l’anode pour les acides nucléiques) dans le gel, et les plus petits segments migrent plus loin que les plus gros. Une échelle moléculaire permet de mesurer la migration et d’estimer le poids moléculaire de l’ADN ou de l’ARN particulier. On peut aussi utiliser cette technique afin de visualiser la qualité de l’échantillon à l’étude.
- Pourquoi fait-on varier la porosité des gels d’électrophorèse utilisés lors de l’analyse des échantillons d’ADN ou d’ARN?
Pour mieux laisser passer des fragments de petite taille et retarder ceux de grande taille. On peut ainsi séparer des fragments de taille différente.
Quel est le rôle du bromure d’éthidium?
Permet de visualiser les fragments d’ADN dans le gel en s’intercalant entre les acides nucléiques. Le BrEt s’étant intercalé entre des molécules d’ADN est fluorescent lorsqu’excité par des rayons UV.
Qu’est-ce qu’une sonde (probe) et quelle est l’utilité d’une sonde d’acide nucléique?
Les sondes nucléotidiques sont des segments d’acides nucléotiques (simple brin) que l’on utilise pour repérer un fragment d’acide nucléique complémentaire (à la sonde) spécifique lors d’une réaction d’hybridation.
Sur quelle base les sondes nucléotidiques fonctionnent-elles?
Ce sont des brins d’ADN simple, complémentaires et antiparallèles par rapport à l’ADN recherché. Elles peuvent s’hybrider avec l’ensemble ou une partie de l’ADN à reconnaître et sont repérables (ex: marquage radioactif interne ou externe)
Quels sont les 2 paramètres physiques les plus importants qui définissent la réaction d’hybridation entre une sonde et sa cible (les deux étant composés d’ADN)?
température & force ionique
Définir ce que l’on entend par une analyse Southern.
L’analyse Southern consiste en le transfert d’ADN sur une membrane à partir du gel de migration (réplique précise de leur migration sur le gel), pour permettre aux fragments de devenir accessibles à une sonde.
Définir le principe de la détection par autoradiographie, par colorimétrie ou par fluorescence.
Autoradiographie: Les molécules d’ADN ou d’ARN marquées radioactivement (P32 ou P33) ou celles qui sont hybridées à une sonde marquée radioactivement peuvent être détecter (à l’aide d’une émulsion d’argent) par exposition à un film autoradiographe.
Colorimétrie: Sondes nucléotides sont couplées à la digoxygénine (reconnu grâce à un anticorps) ou à la biotine (reconnu grâce à l’avidine).
La phosphatase alcaline se fixe à l’anitcorps ou l’avidine, transforme un substrat incolore en un précipité violacé pour permettre la localisation de l’hybridation.
Fluorescence: Sondes nucléotides sont couplées à la digoxygénine (reconnu grâce à un anticorps) ou à la biotine (reconnu grâce à l’avidine). Un anticorps (marqué à la fluorescence) est dirigé contre l’anticorps (anti-digoxygénine) ou l’avidine. UV excitation, fluorescence localisation du complexe d’hybridation.
Définir ce que signifie hybridation in situ, pourquoi utilise-t-on cette technique ?
L’hybridation in situ consiste à déterminer les cellules d’un tissu accumulant une population donnée de ARNm sur coupes histologiques.
On peut utiliser cette technique pour localiser un gène sur le chromosome en performant la réaction d’hybridation sur un étalement de chromosomes en métaphase.
Nommez et expliquez les différentes étapes essentielles à un cycle de PCR.
- Dénaturation (température élevée, séparation des 2 brins)
- hybridation des amorces sur le segment d’ADN simple brin complémentaire
- élongation du brin copie (par la TAQ polymérase)
Nommez 2 caractéristiques que possède l’ADN polymérase utilisée dans la réaction de PCR.
- résistante à la dénaturation
2. Capable de résister à des températures élevées (95-100)
Nommez au moins 3 paramètres qui définissent le choix des amorces utilisées dans la réaction de PCR.
- longueur de 18 à 24 nucléotides
- Contenu en G-C 50%
- Tm entre 64-74 degrés C
- 2 amorces qui ne peuvent pas s’hybrider l’une à l’autre
À quoi sert le hot start (5 min à 95 degré) au début d’un PCR?
Dénaturer l’ADN double brin pour en obtenir des simples brin.
Qu’arrivera-t-il si les amorces ont des séquences complémentaires?
Elles pourront s’hybrider ensemble et générer des dimères d’amorce.
Pour quelles raisons l’amplification par PCR atteint un plateau après un certain nombre de cycles?
Plateau apport de dNTP(nucléotides) épuisé.
Quels sont les avantages d’utiliser la PCR? (3)
Rapide
Sensible
Faible coût
Quels sont les désavantages d’utiliser la PCR? (3)
On doit connaitre la séquence à amplifier Doit être optimisé pour chaque réaction Contamination possible (amplification de produits non désirés)
Peut-on évaluer la quantité d’un ARNm lorsque l’on regarde le produit amplifié par PCR (après 40 cycles)?
Non
Quelle technique puis-je utiliser afin de remédier à cette situation?
qPCR
Quels sont les deux avantages principaux du qPCR par rapport au PCR traditionnel?
Plus rapide
Peut être utilisé pour évaluer qté (grâce à un agent intercalant) à chaque cycle
Quelle molécule permet de suivre l’amplification à chaque cycle d’un qPCR ?
Agent intercalant fluorescent (SYBR green)
Dans la technique de qPCR (PCR quantitatif, PCR en temps réel) à quoi sert la courbe de dissociation (melting curve)?
Pour évaluer si l’échantillon est contaminé. i.e. vérifier qu’il n’y a qu’un seuil produit amplifié.
Lorsque la melting curve est effectuée à la fin d’une réaction de qPCR. Je m’attends à voir combien de pics? Que signifie l’apparition d’un pic à une très faible température?
Un seul pic (un seul amplicon). Pic à très faible température signifie un petit fragment, qui correspond à un dimer d’amorce (2 amorces se sont hybridées) qui a été amplifié.
Quel est l’utilité de gènes comme Rpl19, Gapdh, Hsp90 ou Ldha pour l’évaluation de l’expression de notre gène d’intérêt?
Les housekeeping genes servent de gène de référence et sont utiles pour comparer deux échantillons et évaluer si la différence que l’on observe est réelle, ou si elle est due à une erreur technique.
Définir housekeeping gene (gène de ménage).
Gène dont l’expression n’est pas modifiée peu importe le traitement.
Par qPCR, Quelles est la technique principalement utilisée pour quantifier les ARN complémentaires provenant de deux populations de cellules?
qPCR avec une courbe standard et housekeeping gene.
Par qPCR, Quelles est la technique principalement utilisée pour connaitre la concentration de l’ADN viral dans un tissu infecté.
Courbe standard
Quel est l’avantage d’utiliser des analyses d’expression comme les puces à ADN ou le séquençage de nouvelle génération plutôt que la RT-PCR/qPCR?
Il y a plusieurs milliers de DNA chips par lame, ce qui permet une analyse simultanée de beaucoup de gènes.
Qu’est ce qu’un didéoxyribose? Quel est son rôle lors du séquençage?
C’est le sucre pentose présent dans le didéoxynucléotide. Structure comme le désoxyribose , mais sans le OH au C3.
Empêche la formation d’une liaison phosphodiester 5-3 entre le sucre et le phosphate du prochain nucléotide et donc arrête l’élongation du segment «copie» du brin à amplifier.
Est-il vrai de dire que lors de la réaction de séquençage d’un fragment d’ADN, la réaction effectuée permet de générer tous les fragments possibles d’ADN qui diffèrent l’un de l’autre par seulement 1 nucléotide ?
oui
Pour permettre d’initier une réaction de séquençage par l’ADN polymérase,
a) pourquoi est-il nécessaire d’avoir une amorce ?
b) Dans quelle région du fragment de l’ADN à séquencer allez vous choisir cette amorce ?
a) Car l’enzyme ADN polymérase a besoin d’une amorce à laquelle elle peut attacher le prochain nucléotide. Elle catalyse la formation de la liaison phosphodiester 5-3, elle peut donc seulement rajouter un dNTP au brin, elle ne peut pas le débuter.
b) au debut du fragment à séquencer
Comment l’électrophorèse sur capillaire a amélioré cette technique?
L’électrophorèse sur capillaire permet d’analyser les produits du séquençage sans avoir à fabriquer un gel à chaque réaction de séquençage.
Définir mutation autosomale dominante et autosomale récessive?
Autosomale dominante: Seulement 1 allèle de modifiée = maladie exprimée
Autosomale récessive: Doit avoir les 2 allèles mutées pour exprimer la maladie.
Lors d’une mutation de type autosomale récessive, on dit que l’animal hétérozygote est porteur de la mutation. Définir porteur.
Porteur signifie que l’animal à une de ses deux allèles qui cause la maladie, mais cette dernière n’est pas exprimée puisqu’elle est récessive.
Comment pourrais-je comparer l’ADN d’un suspect d’un crime à l’ADN retrouvé sur le lieu du crime?
En effectuant une digestion de l’ADN et en comparant les profils de coupure par des enzymes de restriction d’une molécule d’ADN à une autre sur un gel de migration (ex: mère-fille).
Comment nomme-t-on un changement d’un nucléotide à une position spécifique lorsque l’on compare la séquence d’un même fragment d’ADN entre 2 individus? Quelle est l’abréviation utilisée?
Single nucleotide polymorphism
SNP («snip»)
Comment les SNPs sont-ils utilisés dans l’industrie laitière?
Ils servent à calculer la Direct Genomic Value (DGV), puisqu’on a établi des corrélations entre certains SNP et des caractéristiques de la vache (ex: quantité de gras dans le lait)
- Nommez un avantage et un désavantage de la technique de fabrication de souris transgéniques par injection.
Avantage: Très facile à réaliser
Désavantage: l’intégration du transgène se fait de façon aléatoire dans le génome.
- Nommez un avantage et un désavantage de la technique de fabrication de souris transgéniques par injection d’un vecteur viral.
Avantage: peut être utilisé chez l’animal adulte
Désavantage: déclenche une réaction immunitaire chez l’animal
- Dans la technique de microinjection, que se passera-t-il si le transgène s’intègre au niveau de l’hétérochromatine?
Le transgène ne sera pas exprimé, puisque l’hétérochromatine est compacté, ce qui empêche l’expression du gène.
- Dans une souris KO, pourquoi la première génération de souris est mosaïque?
Parce que pour produire la souris KO, on injecte des cellules ES modifiées (gène inactivé) dans le blastocyste, et ces cellules s’intègrent à l’ensemble de cellules à partir duquel toutes les futures cellules de l’organisme vont être différenciées.
À la naissance, les tissus se sont formés avec des cellules différenciées, certains à partir de cellules «normales» et certains à partir de cellules ES modifiées.
- Quelle enzyme est utilisée lors de la fabrication de souris knock-out conditionnel spécifique au tissu afin de permettre la recombinaison? Si je veux cibler les cellules d’un tissu X, quel promoteur devrais-je choisir pour contrôler l’expression de cet enzyme?
L’enzyme CRE (reconnait séquence palindromique; activité topoisomérase/recombinase) placée devant un promoteur spécifique à un type cellulaire
- Comment puis-je générer un modèle de souris qui inactivera l’expression d’un gène à la fois dans un tissu précis et à un moment précis?
Système Tet-On
Nommez les deux modes de réparation de l’ADN pouvant intervenir lors de la fabrication de souris par la méthode CRISPR/Cas9
- Recombinaison homologue (nécessite un dédoublement de l’ADN)
- Recombinaison d’extrémités non-homologues.
- Quel serait le plus grand avantage à utiliser des cellules souches spermatogoniales (SSCs) plutôt que des cellules ES afin de générer des souris KO?
Ce sont des cellules souches d’une cellule germinale alors elles seront transmises aux générations futures (i.e. héritables).
