Functional genomics (II)

Question 1

Definitie functional genomics

Answer 1

hoe genen en intergene regio’s van het genoom bijdragen aan verschillende biologische processen. Met als doel te bepalen hoe de individuele componenten van een biologisch systeem samenwerken om een bepaald fenotype te produceren.

Question 2

Knockout

Answer 2

Het hele gen bevindt zich niet in de cel/het organisme en kan dus niet tot expressie worden gebracht

Question 3

Knockdown

Answer 3

sommige delen van de expressie kunnen blijven

Question 4

Pooled screen

Answer 4

Genereren van een bibliotheek van shRNA, infecteren van een pool van cellen met dit shRNA en identificeren welke cellen deze infectie hebben overleefd. Elke cel heeft een streepjescode en op basis hiervan kun je de verschillen tussen de cellen kennen.

Question 5

Arrayed screen

Answer 5

In een plaat met meerdere putjes wordt iets als siRNA/shRNA dat plasmide/viraal verpakt shRNA tot expressie brengt toegevoegd om het fenotype daarna te meten. Er kunnen viability assay, wound healing assay, fluorescente reporter- en imaging uitgevoerd om het fenotype van de cel te bepalen. Als cellen niet bewegen, kan dat met siRNA, maar niet voor migrerende cellen, omdat die wel zouden bewegen.

Question 6

Things to take into account when designing a phenotypic screen.

Answer 6

1. Which omics do you want to investigate?
2. Which library do you want to screen?
3. Which cell model do you want to use?
4. Which readout type do you want to use?
5. Which imaging technology do you want to/can you use?

Question 7

Image analysis steps:

Answer 7

1. Raw image
2. Pre-processing noise filtering
3. Binarization per mask
4. Collecting everything in the mask.
5. Object identification.
6. Image analysis.

Question 8

Batch effect

Answer 8

Zijn technische, niet-biologische factoren die ook de variatie in de resulterende gegevens beïnvloeden, maar ze komen voor in batches monsters. Een batch verwijst naar een individuele groep monsters die anders worden verwerkt dan andere monsters in het experiment.

Question 9

Plate-layout effects

Answer 9

Systematische variatie over de geometrie van de microplaat of over verschillende platen als gevolg van factoren zoals de locatie van de put, temperatuur en vochtigheid. Experimenten uitgevoerd met behulp van microplaten vertonen gewoonlijk plaateffecten.

Question 10

miRNA

Answer 10

Een vorm van niet-coderend RNA (20-25 nucleotiden) en is onderdeel v/h mechanisme dat de expressie van genen reguleert.

Question 11

Mechanisme RNA interference (RNAi)

Answer 11

1. dsRNA wordt gespleten in kleinere fragmenten door DICER.
2. AGRONAUT (Ago) bind aan siRNA en vormen samen RISC.
3. De strand van RISC is complement aan mRNA en bind wat zorgt voor silencing.

Question 12

siRNA vs CRISPR

Answer 12

1. siRNA in cytoplasma en CRISPR in DNA nucleus.
2. siRNA zorgt voor knockdown en CRISPR voor knockout.

Question 13

threshold (microscopy)

Answer 13

Er wordt een threshold gebruikt om de rand van de cellen te vinden. Alle pixels helderder dan x zijn cellen, de rest niet. Zo kun je ook zien welke met elkaar verbonden zijn en de cellen dienovereenkomstig splitsen

Question 14

Luciferase reporters voordelen:

Answer 14

1. Vereist slechts een eenvoudige plaatlezer voor uitlezing.
2. Zeer hoge gevoeligheid
3. Hoge reproduceerbaarheid.

Question 15

Luciferase reporters nadelen:

Answer 15

1. Vereist energie
2. vereist toevoeging van luciferine.
3. in de meeste gevallen wordt niet de endogene doelgenexpressie gevolgd.
4. translocatie van eiwit kan niet worden gevolgd.
5. In de meeste gevallen gaat het om een eindpuntmeting. geen live-celbeeldvorming.

Question 16

Fluorescent reporters voordelen:

Answer 16

1. Lange halfwaardetijd van reportereiwit.
2. Flexibele uitlezing (meerdere FP’s).
3. hoge reproduceerbaarheid.
4. geen substraat nodig
5. translocatie van doeleiwit kan worden gevolgd.

Question 17

Fluorescent reporters nadelen:

Answer 17

1. Vereist een duurdere uitlezing
2. Het effect van fluophore op de functie van het doeleiwit is vaak onbekend

Question 18

Oxidatieve stress pathway

Answer 18

Keap 1 - Nrf2 - Srxn1

Question 19

DNA damage response pathway

Answer 19

53BP1 - p53 - p21

Question 20

Mechanisme CRISPR/Cas9

Answer 20

1. gRNA identificeert en bindt zich aan de specifieke PAM-sequentie (Protospacer Adjacent Motif) in het DNA.
2. gRNA zorgt ervoor dat het DNA zich ontspant, waardoor de interactie met het gRNA wordt vergemakkelijkt.
3. CAS9-eiwit knipt het DNA, waardoor een dubbelstrengsbreuk ontstaat.
4. Het DNA-reparatiemechanisme, niet-homologe eindverbinding (NHEJ), probeert de dubbelstrengsbreuk te herstellen, wat vaak tot fouten leidt.
5. Fouten in het reparatieproces kunnen resulteren in het uitschakelen van het beoogde gen.