Dogma of life (I) Flashcards
Sanger Sequencing
Methode voor DNA-seq waarbij elektroforese betrokken is. Het is gebaseerd op de willekeurige incorporatie van ketenbeëindigende dideoxynucleotiden door DNA-polymerase in vitro DNA replicatie.
Dideoxynucleotiden
Missen de OH-groep, de plek van het hechten van een nieuw nucleotide waardoor de DNA-synthese stopt.
Illumina stappen
- Library preparation
- Cluster growing
- Sequencing
- Alignment and data analysis
Illumina doel
Illumina-kleurstofsequencing is een techniek die wordt gebruikt om de reeks basenparen in DNA te bepalen, ook wel DNA-sequencing genoemd.
Exome sequencing steps
- Het selecteren van alleen de subset van DNA die codeert voor eiwitten (exons).
- Het sequencen van het exonische DNA met behulp van een high-throughput DNA-sequencing-technologie.
Exome seq pipline
- Snijd in kleinere fragmenten.
- Hybridiseer de opname van het hele exoom.
- Wassen/elueren -> NGS.
mRNA sequencing
- PolyA+ RNA captured.
- RNA fragmented and primed.
- First strand cDNA synthesized.
- Second strand cDNA synthesized.
- 3’ ends adenylated and 5’ ends repaired.
- DNA sequencing adapters ligated.
- Ligated fragments PCR amplified.
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) doel
Chromatine-immunoprecipitatie is een methode uit de moleculaire biologie om interacties van eiwitten met kernmateriaal na te gaan. Zo kunnen transcriptiefactoren opgespoord worden.
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) steps
- Crosslinking (formaldehyde).
- Lysis and sonication.
- Immunoprecipitation.
- Decrosslinking and purification of DNA.
- Analysis of ChIP-DNA.
Genome =
Alle erfelijke informatie gecodeerd in het DNA.
Transcriptome =
Verzameling van alle mRNA’s (‘transcripten’) geproduceerd uit een genoom. Het varieert omdat het genen weerspiegelt die op een bepaald moment actief tot expressie komen.
Large scale genomic variations
- Translocaties = het verplaatsen van een DNA-segment van het ene chromosoom naar het andere chromosoom.
- Inserties = de toevoeging van een of meer nucleotiden aan een DNA-segment.
- Deleties = het verlies van een of meer nucleotiden uit een DNA-segment.
Medium scale genomic variations - CNV
Copy number variations is een algemene term die wordt gebruikt om een moleculair fenomeen te beschrijven waarbij sequenties van het genoom worden herhaald en het aantal herhalingen varieert tussen individuen van dezelfde soort.
Medium scale genomic variations - repeat expansions
- VNTRs = variable number tandem repeats (14-100 bp).
- STRs = short tandem repeats (2-10 bp).
- SSRs = short simple repeats (1-4 bp).
Microscale genomic variations
Single nucleotide polymorphisms (SNPs).
SNP is een genomische variant op een enkele basepositie in het DNA.
RNA sequencing steps
- RNA extraction
- RNA fragmentation
- cDNA generation
- Library amplification
- Sequencing on NGS platforms
Bisulfite conversion
Doel = patroon methylering bepalen.
Bisulfite veranderd niet-methyleerde C in U en methyleerde C blijven onveranderd. Door PCR-amplificatie wordt U -> T.
Top-down approach
Monster van belang, extractie van interessant eiwit, scheiding en metingen daarop. Je weet vooraf met welk soort eiwit je te maken hebt.
Bottom-up approach
Kleinere peptiden worden verkregen, analyse en metingen van een peptide. Dit wordt vaker gebruikt en biedt meer gedetailleerde informatie.
Liquid chromatography (LC)
Analytische methode waarbij er gebruik wordt gemaakt van het verschil in affiniteit van stoffen met zowel de mobiele als de stationaire fase.
The resolving power of a column
N (plate number) = L (column length) / H (plate height).
Mass spectrometry-based data analysis pipeline
- Protein extraction from cells, enzymatic digestion.
- Purification and visualization are done by chromatography, SDS-PAGE, or 2D-PAGE.
- A chopped-up protein (peptides) has many ms values, so a computer is used to determine the amino acids.
- Each protein/peptide gets its m/z and CID.
- Analyzed by LC-MS (liquid chromatography-mass spectrometry).
- Identification by database searching and matching.
