Föreläsning 1 Flashcards
Vad är biomolekyler?
De är proteiner, DNA, RNA, lipider, kolhydrater, vitaminer och metaboliter som alla innehåller kol, väte, kväve och syre.
Vad innebär en naturlig proteinkälla?
Källor som förekommer i naturen, kan vara blod, hud, mjölk växter osv.
Fördelen med detta är att målproteinet är de korrekta. Nackdel är att det kommer vara en liten koncentration av målprotein och mycket annat.
Vad innebär en syntetisk proteinkälla?
Är ett protein som framställts kemiskt. Fördelen med detta är att koncentrationen av målprotein kommer vara hög däremot är längden aminosyror begränsad till 50-100 beroende på utrustning.
Vad innebär rekombinant proteinkälla?
Proteiner som uttrycks mha värdorgansimer. Detta är den mest använda metoden eftersom de går att göra post - transtionell - modifiering (PTM) vilket innebär mofrfiering som ex glykosylering, och fosforylering etc. Det går att producera protein i högre koncentration. Detta kan också bildra inklusionskroppar (kroppar av aggrererat protein) som också går att rena. Proteiner som inte är i inklusionskroppar kommer dessutom vara korrekt veckade eftersom de befinner sig i sin naturliga miljö. I vissa fall går de också att sekretera proteinet till mediet.
Hur går extraktion från växter till?
växtceller har cellvägg som behövs förstöras för att komma åt proteinet.
- Blenders - materialet skärs sönder.
- homogenizer - material som pressas genom hålrum.
- grinding - materialet mals eller mortlas med tillsatt sand eller kulor för att öka effektiviten. Dynomill är exempel för mer storskalig produktion.
Hur går extraktion från vävnad till?
Mammalieceller av extracellulärmatris (ECM), fett och senor i vävnad kan delvis renas bort genom
- Blenders - materialet skärs sönder.
- homogenizer - material som pressas genom hålrum.
- grinding - materialet mals eller mortlas med tillsatt sand eller kulor för att öka effektiviten. Dynomill är exempel för mer storskalig produktion.
Hur går extraktion från mammalieceller till?
Mammalieceller kan också sekretera protein ut till mediet men om inte kan plasmamembranet (mammalieceller saknar cellvägg) lyseras genom
- frys torkning - från EtOH/torris till 37 grader för att sedan upprepas om behövs.
- sonikering - där ultraljud som har en frekvens större än 20 kHz kommer skapa skjuvkrafter och kavitation som kommer förstöra plasmamembranet.
- kemiskt - med detergent som exempelvis SDS för att lösa upp membranet.
Hur extraheras proteiner från jäst celler?
I vissa fall kan protein sekreteras till medium men om det inte är möjligt kan cellen lyseras. Det är svårare att lysera denna cell eftersom den innehåller både polysackarid och glykoprotein lager.
- beadmills - celler och kulor som roteras tillsammans vilket kommer kollidera och skapa skjuvkraft som lyserar cellen.
- pressar/tryckförändning - plötsliga tryckförändringar som skapar skjuivkrafter som förstör cellen. för mindre skala använda french press och större skala high pressure homogenizer.
- enzymatisk/kemisk lysering - enzymer med glucanase aktivitet bryter ner cellväggen. cellväggen hos vissa jästceller kan lyseras delvis med toluen.
Hur fungerar extraktion från bakterier med intracellulärt protein?
För att slå sönder cellmembranet används
- sonikering - där ultraljud som har en frekvens större än 20 kHz kommer skapa skjuvkrafter och kavitation som kommer förstöra plasmamembranet.
- Pressar/tryckförändingar - plötsliga tryckförändringar som skapar skjuivkrafter som förstör cellen. för mindre skala använda french press och större skala high pressure homogenizer. Det går ocskå att göra med cell bomb där kvävas används för att ge stor tryckförändring.
- enzymatiska metoder - lysozymer bryter peptidoglykan i cellvägg. EDTA kan behövas för att destabilisera LPS på gram negativ bakterier. Detergent kan behövas för att lösa upp cellmembran.
Hur fungerar extraktion från bakterier till periplasma?
Det kan ibland vara svårt att sekretera till mediet men de kan vara möjligt att sekretera till periplasman. Detta ger färre andra proteiner att rena bort och extraktionen sker genom osmotisk tryck (diffusionsgradient)
Hur fungerar extraktion från bakteriers membran?
Vissa proteiner kan fastna i membranet eftersom de kan innehåller en signalpeptid för detta eller är hydrofoba proteiner. För att lösa upp membranet tillstätts detergent som exempelvis SDS, CHAPS, eller TritonX.
Vad är celldebris?
Trasiga celler efter lysering. Detta kan separeras bort genom centrifugering. Celldebris kommer då hamna i en pellet i botten medan proterint hamnar i supernatanten (lösningen med proteinet). i vissa fall kan supernatanten också behövas filteras efter centrifugering för att ta bort eventuellt aggregat eller mindre delar av celldebris.
Hur koncentrationsbestämms ett prov?
Genom absorbansmätning vid ljus av maximal våglängd på 280 nm detta pga aminosyrorna Trp>Tyr»Phe, Cys, His. Mha Beer - Lamberts lag beräknas sedan koncentrationen.
Vad är SDS - page, och hur fungerar det?
Är en metod för identifiering av protein och kontroll av renhetsgrad. Metoden separerar proteiner baserat på storlekt. SDS denaturerar proteiner och täcker dessa med laddande SDS molekyler. proteiner kommer förflyttas mot den positiva noden och de som är mer negativa dvs större kommer närmare denna nod vilket separerar proteinerna.
Hur görs fällning av proteiner efter SDS - page?
Coomassie brilliant blue - I sura lösningar binder färgämnet till proteinet (främst baskiska aminosyror). Innan färgämnet binder är den brunaktig medan efter inbindning så blir ämnet blått.
Silver staining - är mer känslig än Coomassie. denna är mer tidskrävande och känslig för artefakter
Flourescent dyes - det finns flera olika av dessa färger som både är snabbare och enklare att använda än silver staning.
