Fermentation Flashcards
Qu’est-ce que l’étude d’enzymes avec essai couplé?
◼ Exemple: Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase GAPDH
◼ Mesurer la production de NADH avec spectrophotométrie à 340 nm
◼ Calcul des concentrations
Qu’est-ce que l’étude du mécanisme enzymatique de la GAPDH?
Études avec inhibiteurs et avec isotopes
- transfert d’un groupement phosphate pour un H + H+
Qu’est-ce que l’étude du mécanisme enzymatique de la GAPDH par l’utilisation d’inhibiteurs?
Utilisation d’inhibiteurs de fonction connue
* Formation d’une liaison covalente avec l’inhibiteur
* Détection de la molécule résultante possible
Quel est l’exemple de l’emploi de l’iodoacétate?
o L’exemple utilisé emploie l’iodoacétate, un agent alkylant
o Si l’enzyme est inhibée, cela indique que son mécanisme implique une
cystéine
Avec quelle méthode peut-on détecter la molécule résultante?
Spectrométrie de masse
Pourquoi l’iodoacétate inhibera seulement les cystéines du site actif et pas les autres cystéines?
+ accessibles que les autres
Qu’est-ce que l’étude du mécanisme enzymatique de la GAPDH par l’utilisation de substrats marqués?
En marquant différents résidus du substrat, il est possible de valider
lesquels sont impliqués dans la réaction
Que permet de suivre l’utilisation de tritium?
l’utilisation de tritium (3H) permet de suivre l’apparition de NADH marqué et de déterminer quel hydrogène est impliqué dans la réaction.
* Permet de voir que le mécanisme est un transfert direct d’ion
hydrure
Est-ce qu’il y a des conditions partculières qui peuvent limiter
l’utilisation des résultats de cette expérience? Pourquoi?
- Fonctionne seulement in vitro avec des enzymes purifiées car plusieurs réactions enzymatiques produisent du NADH.
- Si on prenait un extrait cellulaire par exemple, on ne connaitrait pas
la provenance du NADH marqué (pourrait venir d’une autre réaction enzymatique)
Qu’est-ce que l’étude du mécanisme enzymatique de la GAPDH par l’utilisation d’intermédiaires acyl-enzyme?
*L’intermédiaire acyl-enzyme est un intermédiaire transitoire et difficile à étudier : c’est un complexe qui se forme entre le substrat et l’enzyme dans plusieurs enzymes importantes et qui est essentiel à la catalyse
*L’échange isotopique permet de faire la distinction entre réaction ping-pong et séquentielle
Signification échange isotopique
Mécanisme ping-pong : s’il n’y a pas de second substrat, échange isotopique possible
Mécanisme séquentiel : pas d’échange isotopique possible à cause du complexe enzyme-substrat
Exemple acétyl phosphate
- En utilisant du phosphate inorganique marqué avec un isotope on observe que :
- GAPDH échange le phosphore de l’acétyl phosphate avec le phosphore du phosphate inorganique
- C’est la réaction inverse qui est utilisée (1,3- BPG (ici acétyl phosphate) + H+ → GAP + Pi)
Fermentation homolactique
- Le NAD+ est renouvelé grâce à la réduction de pyruvate
- Dans le muscle et les bactéries lactiques
- Enzyme : lactate déshydrogénase (LDH)
- La LDH est stéréospécifique-transfert de l’ion hydrure
Cofacteur NAD
- NAD = Nicotinamide adénine dinucléotide
- Cofacteur pour les oxydoréductases * Porteur des équivalents réducteurs
Isoformes LDH
- Enzymes LDH sont tétramères dans les mammifères
- Deux types de sous-unités dans les mammifères: M et H
- Donne 5 isoenzymes : M4, M3H, M2H2, MH3, H4
- H domine dans tissus aérobies (muscle cardiaque)
- M domine dans les tissus qui peuvent être en anaérobie (muscles squelettiques et foie)
Régulation des isoformes de LDH
- La régulation allostérique de la LDH par le pyruvate diffère selon les isoformes
- H4 est inhibée par le pyruvate (tissus aérobie)
- M4 n’est pas inhibée par le pyruvate (tissus anaérobie)
Les isoenzymes sont?
Des enzymes codées par des gènes similaires, mais pas identiques
Isoenzymes
Enzymes qui sont issues de différences dans la structure primaire
(chaîne peptidique). Cause = génétique
* Pas approprié de nommer isoenzymes des différences causées par des modifications post-traductionnelles
* Ont généralement des propriétés physicochimiques différentes (ex: mobilité électrophorétique, résistance à l’inactivation thermique
ou chimique)
* Ont généralement des différences dans leurs propriétés catalytiques
* Peuvent toutes catalyser la même réaction
Pourquoi produire du lactate?
Permet de regénérer le NAD+ qui est nécessaire à maintenir la glycolyse
Effet de Warburg
- L’effet Warburg - usage d’une voie métabolique «défavorable» ( prod. ATP)
- Conversion de glucose en lactate malgré la présence d’oxygène
Avantages glycolyse vs phosphorylation oxydative
Voies de biosynthèses alternatives sont favorisées : Constituants nécessaires à la prolifération cellulaire
Avantage pour cellules qui se divisent rapidement
Test colorimétrique de la lyse des cellules
- La LDH est présente dans toutes les cellules
- La LDH se retrouve dans le surnageant des cultures si les cellules
lysent, p.ex. en présence d’un composé toxique - En mettant les cellules en culture en plaques multi-puits, il est possible de tester de multiples conditions de toxicité (composés et doses) grâce à un test enzymatique simple
Application de la LDH pour tests de toxicité
La détection de la LDH (indicateur de lyse cellulaire) est possible avec un essai couplé de deux réactions enzymatiques :
La réduction du formazan peut être mesurée par spectrophotométrie
LDH biomarqueur en clinique
L-Lactate + NAD+ + H+ → Pyruvate + NADH+
Dosé en contexte clinique pour voir la lyse tumorale (leucémies, autres cancers) ou la lyse cellulaire générale (choc, trauma)
Importance LDH pour système immunitaire
- On observe l’effet Warburg dans les cellules du système immunitaire
- Activation des cellules-T liée à un métabolisme très actif et rapide
- Induction de la lactate déshydrogénase A (LDHA)
- Délétion de la LDHA réduit le fonctionnement du système immunitaire
Application LDH
Le gène de la LDH est stimulé par
l’oncoprotéine Myc et par HIF («hypoxia-induced factor»)
-> indique un rôle dans les cancer)
FX11
FX11 est un inhibiteur compétitif de la LDH
-> test avec modèle animal d’un cancer
* Résultat: Inhibition de la LDH inhibe la croissance des tumeurs
Pourquoi est-ce qu’il y a moins d’oxygène dans les tumeurs par rapport aux tissus normaux (hypoxie)?
Les tumeurs sont moins alimentées par le système vasculaire.
Fermentation alcoolique
- Alternative pour régénération de NAD+
- Dans la levure et des bactéries
- Enzymes : pyruvate décarboxylase (PDC) et alcool déshydrogénase (ADH)
- La pyruvate décarboxylase ne se trouve pas dans le règne animal
Thiamine pyrophosphate (TPP)
- Cofacteur de la pyruvate décarboxylase et d’autres décarboxylases
- Permet de stabiliser l’état de transition (instable)
Béribéri
maladie due à la déficience en thiamine (Vitamine B1)
Cause principale : la malnutrition -> montre l’importance pour le métabolisme
Mécanisme alcool déshydrogénase
- Transfert de l’ion hydrure de NADH * Zn2+ au site actif polarise le groupement carbonyle
- ADH du foie catalyse la réaction inverse
- Dégradation via acétaldéhyde (toxique) et acétate –> TCA
Contrôle flux métabolique
Défini par sa (ses) réaction(s) limitante(s)
* 1. Contrôle allostérique de l’enzyme (PFK)
* 2. Modification covalente de l’enzyme (p. ex.phosphorylation)
* 3. Cycles de substrats
* 4. Contrôle génétique
Contrôle allostérique de l’enzyme
- Réaction qui a lieu le plus
rapidement
*Par contre c’est un mécanisme réversible et dynamique
*Régulation de l’enzyme par liaison d’une autre molécule, qui l’inhibe - Peut être effectué par : substrats, produits ou cofacteurs
- Souvent par le dernier produit
de la voi
Modification covalente de l’enzyme
- Effet plus durable
- Mécanisme rapide, mais nécessite un peu plus de temps que le rétrocontrôle allostérique
- Les enzymes peuvent posséder des sites spécifiques qui peuvent être modifiés
- Ces modifications vont affecter l’activité de l’enzyme
- Parmi ces modifications, une des plus fréquentes est la phosphorylation (sérine, thréonine, tyrosine)
- La phosphorylation est effectuée par des et médiée par les phosphatases
Cycle de substrats
- Certaines réactions enzymatiques peuvent se faire dans les deux
sens. - Si les deux réactions sont différentes, elles peuvent chacune être influencée de façon indépendante
- Dans un tel cas, les concentrations des effecteurs allostériques aura
un plus grand impact encore
Contrôle génétique
- La régulation génique est un autre mécanisme permettant de contrôler les voies métaboliques
- Contrôle directement la synthèse des différentes enzymes et donc leur concentration.
- Mécanisme de contrôle à plus long terme (quelques heures à quelques jours)
Maintien homéostasie
*L’état stationnaire est le plus efficace thermodynamiquement dans un système ouvert comme le métabolisme
* Plusieurs métabolites sont impliqués dans plusieurs voies : une
modification de leur concentration peut perturber l’équilibre délicat
entre les voies
*La vitesse de réponse d’une voie métabolique à un signal de contrôle sera plus lente s’il y a des changements importants dans la
concentration des métabolites
* De grandes variations de concentration des métabolites peut
modifier les propriétés osmotiques des cellules
Conditions standards
25ºC (298 K)
1 M concentrations de tous les réactifs et produits
pression de 1 atm
pH=7
Phosphofructokinase (PFK)
- Une enzyme tétramérique
- Substrats : ATP et F6P * Catalyse transformation du Fructose-6-phosphate (F6P) en Fructose-1-6-bisphosphate (FBP)
- Deux sites de liaison à l’ATP par sous-unité
- L’ATP agit à la fois comme substrat de la PFK, et comme effecteur
allostérique négatif de la PFK. - Un des deux sites de liaison est pour l’ATP en tant que substrat
- L’autre site de liaison est un site régulateur (inhibition)
Régulation PFK
- Deux états conformationnels R et T * Le site du substrat fixe l’ATP peu importe l’état conformationnel
- État R - fixe préférablement 2e substrat F6P
- État T –seul état dans lequel le site de régulation fixe l’ATP
-> Si forte concentration d’ATP : favorise l’état T et donc moins de liaison pour F6P
* Réduction de l’affinité pour F6P et variation 100x de l’activité : pas expliqué par ATP seul. AMP aussi joue un rôle
Pourquoi est-ce que le repositionnement de médicaments est avantageux?
Réponse 3: Développement pour de nouvelles applications sera moins cher.
Réponse 4: Il est plus facile et de procéder à des essais cliniques
