Expression d'une protéine recombinante dans une bactérie Flashcards
Qu’est-ce qu’une protéine recombinante?
Une protéine recombinante résulte de l’expression, par un organisme ou une cellule hôte, d’un ADN recombiné, étranger ou non.
Quels sont les hotes d’expressions possible, et leur caractériques?
- Levures: Culture aisée en fermenteur. Niveau de production : 1g/L de culture max
- Cellules animales: Faible capacité de production : 10mg/L
- Cellules d’insectes : Concentration elevée de protéines recombinantes par rapport aux autres systèmes eucaryotes.
- Bactéries : Génétique connue, facile a cultiver, G court, couts faibles, grande capacité de production, Protéines recombinantes = 30% des protéines cellulaires totales. MAIS absence de glycolysation et accumulation de lps (endotoxin)
La glycosylation est la modification post traductionnelle la plus importante dans la nature. En quoi elle consiste?
Ajout post traductionnel de sucres sur protéine (très rare chez les bactries, inexistante chez coli)
Role de la glycosylation ?
- Reconnaissance et adhésion cellulaire
- Contrôle du repliement de la protéine
- Acquisition de fonctions biologiques
- Transport et adressage de la protéine
- Réponses immunitaires
- Stabilité de la protéine
2/3 des protéines eucaryotes sont potentiellement glycosylées.
Quels sont les deux types de glycosylation?
N-glycolysation et la O-glycolysation.
Donner les étapes de l’expression chez E.Coli
1- Transformation de E.Coli avec le Plasmide Recombinant.
2- Culture de la bactérie
-Amplification du PR
- Division cellulaire
3) Induction de l’expression du gène, production de la protéine recombinante.
4) Lyse des cellules
putification de la protéine.
Comment choisir le plasmide ?
- Site ORI : Replication + controle de nb de copies du plasmide, indépendante de celle de la bactérie
- Site MCS : Multi cloning site
- TAG : Détection protéine, purification, augmente la solubilité de la protéine
- Séq pour couper le tag
- Séq terminator
- Promoteur : induction de l’expression de la protéine recombinante.
A quoi peut etre du un niveau faible ou aucun niveau d’expression ?
- Toxicité de la protéine
- Usage des codons de la protéine cible qui différe des usages des codons de l’hote.
- Formation de corps d’inclusion dépourvus d’activité biologique.
Quelles solutions a la toxicité de la protéine?
-Controle du niveau de la base de la synthese de la protéine. (expression d’un répresseur comme lacI, addition de glucose dans le milieu pour declencher RP)
- Production d’un faible niveau de protéine
- Oter la protéine de la cellule adressage dans le périplasme ou un milieu extracellulaire.
Quelles solutions a l’usage de codons qui different ?
Niveau d’expression optimisés :
- optimisation de codons en ramplacant les codons rare par des codons majeurs
- Utilisation d’un hote qui surexprime les arnt des codons rare
Quelles solutions a la formation de corps d’inclusion ?
Re-solubilisation. (CI => Centrifugation => CI purifiés => Resolubilisation (avec dénaturants et agent reducteurs) => PRoteine solubilisées dénaturées => repliement + dyalise pour éliminer le dénatuant => Protéines solubilisées)
Role et problemes des ponts disulfures?
- Interviennent dans la stabilisation de la structure tertiaire
- Présents dans le site actif de certaines protéines et impliqués dans des processus d’oxydoréduction ou de transports d’électrons (thioredoxine)
- Problème: la formation de ponts disulfures erronés peut conduire à un mauvais repliement et donc à l’agrégation de la protéine et à la formation de corps d’inclusion
Qu’est-ce que les chaperonnes?
Ce sont des protéines en grande concentration dans toutes les cellules et permettent le bon repliement des protéines. Elles permettent aussi de dissocier des corps d’inclusion formés. Synthèse induite par un choc thermique : heat shock proteins (Hsp)
Peut on produire des ponts disulfures chez EColi?
SSi on l’envoi dans le periplasme.
