Examen final (labo 5 à 12) Flashcards
Quel est le paramètre permettant de séparer les protéines dans le SDS-PAGE?
Leur poids moléculaire
Quels sont les 2 forces en jeu lors d’un SDS-PAGE?
- Force électromotrice
- Force de friction
Que doit-on faire pour faire varier la force électromotrice et de friction?
- Électromotrice: Ajuster le voltage imposé à notre système
- Friction: Viscosité du milieu
Quel est le gel utilisé pour l’électrophorèse?
Gel de polyacrylamide
À quoi ressemble le gel d’acrylamide par rapport aux protéines?
Un tamis
Où se retrouvent les grosses et les petites protéines sur le gel après l’électrophorèse? Expliquez le principe
Les grosses protéines demeurent dans le haut du gel, dans la zone de largage de l’échantillon tandis que les petites protéines seront plus vers le bas puisqu’ils passent plus facilement à travers le gel
Expliquez pourquoi il est primordial de mettre du sodium dodécyl sulfate (SDS) avant de débuter l’électrophorèse?
Le SDS a comme fonction de charger négativement TOUTES les protéines du milieu. Ainsi, cela permet d’analyser uniquement 1 paramètre soit la taille des protéines. On ne veut pas qu’il y est d’interférence avec les charges en plus puisque nos résultats ne seront pas attribuables à un paramètre.
Expliquez le lien logarithmique entre la distance de migration et le poids moléculaire des protéines. Quelle serait la conclusion quant au pourcentage d’acrylamide?
Une protéine de poids moléculaire faible est plus affectée dans sa distance de migration qu’une protéine de poids moléculaire élevée.
La variation du pourcentage d’acrylamide a un effet plus important sur la résolution des petites protéines que sur les grosses protéines
Pourquoi utilise-t-on le TMB?
Il est le substrat permettant d’obtenir un produit coloré avec les anticorps couplé à la HRP
Qu’est-ce que la HRP? Rôle?
Horse Radish Peroxydase: C’est une enzyme peroxydase qui souvent couplée à un anticorps permet d’émettre de la chemiluminescence afin de voir “indirectement” l’antigène. Le coloration se fait lorsque la peroxydase catalyse une réaction qui forme un produit coloré.
Quel produit permet de dénaturer de façon irréversible et complète les protéines?
Le beta-mercaptoéthanol contenu dans le tampon d’échantillon
Quel est le rôle du TEMED?
Il permet d’activer la polymérisation du gel
Pourquoi doit-on transférer le gel d’acrylamide sur une membrane de nitrocellulose?
Les anticorps se fixent mieux sur la membrane de nitrocellulose que sur le gel d’acrylamide
Pourquoi a-t-on besoin d’utiliser le rouge de Ponceau?
Il permet de donner une aperçu rapide de la présence ou non de protéines
Pourquoi doit-on hybrider la membrane de nitrocellulose avec du lait? Comment s’appelle ce processus?
Les protéines de lait viendront se coller partout sur la membrane où il y a absence de protéines d’intérêt. Ainsi, la résolution est augmenté puisque les anticorps se colleront uniquement sur l’épitope d’intérêt. Il n’y aura pas de faux positifs. C’est l’étape du blocage
Quel est le traitement utilisé pour les cancers hormonaux-dépendants?
Tamoxifène
Qu’arrive-t-il si on utilise le tamoxifène pour un cancer hormonaux-indépendants?
Il ne se passe rien. Le cancer continuera son développement
Quelle est la différence entre les lignées cellulaires
et MCF-7 et MDA-MB-231? Quelle ligne cellulaire est plus maligne?
La lignée MCF-7 contient des récepteurs d’œstrogènes tandis que MDA-MB-231 n’en contient pas. MDA-MB-231 est plus maligne puisqu’elle ne répond pas au traitement antagoniste de ERalpha.
Pourquoi est-ce qu’on utilise un anticorps secondaire et pas juste un anticorps primaire?
L’anticorps secondaire permet d’économiser dans les laboratoires puisqu’il peut reconnaître plusieurs anticorps primaires d’espèces similaires.
Pourquoi est-ce qu’un anticorps secondaire est capable de réagir avec un anticorps primaire?
L’anticorps primaire est injecté à une espèce dans le but qu’elle développe des anticorps secondaires ayant une spécificité contre l’anticorps primaire.
Pourquoi est-ce qu’un anticorps secondaire ne se fixe pas aux protéines déjà sur la membrane et se fixe à l’anticorps secondaire seulement?
L’anticorps secondaire possède une spécificité pour l’anticorps primaire seulement. Pas pour la protéine de la membrane
Qu’arriverait-il si on prenait un anticorps primaire venant de la souris et qu’on utilisait un anticorps secondaire dirigé contre les anticorps de lapin? Est-ce que l’on verrait les mêmes bandes?
On ne verrait pas de bandes. Puisque les anticorps secondaires ne sont pas dirigés contre les bons anticorps primaires. Ainsi, on ne verrait pas de coloration puisqu’il n’y a pas de liaison établie.
Qu’arriverait-il si, dans une expérience de Western Blot utilisant des protéines issues de cellules de souris, on utilisait un anticorps primaire venant de la souris et qu’on utilisait un anticorps secondaire dirigé contre les anticorps de souris? Est-ce qu’on serait capable d’identifier spécifiquement les protéines à l’étude? Quel genre de résultats nous aurions?
Rien (on ne veut pas dénaturer les protéines de l’organisme même, alors il y aura un lien entre l’a-c primaire et secondaire mais comme elle ne peut se lier au prot de souris lors du lavage on va tout retirer)
La technique d’électrophorèse utilisée aujourd’hui fait usage d’un gel à pH discontinu, aussi appelé gel de Laemmli, qui a été inventée en 1970. Pourquoi est-ce important d’avoir un gel de compression et un gel de séparation pour résoudre les protéines lors de l’immunobuvardage? Décrivez aussi le processus biochimique expliquant cette technique?
Le gel de compression permet de concentrer les bandes protéique afin que leur entrée dans le gel de résolution soit facile et que leur séparation subséquente soit distincte. Le gel de résolution est plus polymérisé tandis que le gel de compression est moins polymérisé.
