Examen final (labo 5 à 12) Flashcards
Quel est le paramètre permettant de séparer les protéines dans le SDS-PAGE?
Leur poids moléculaire
Quels sont les 2 forces en jeu lors d’un SDS-PAGE?
- Force électromotrice
- Force de friction
Que doit-on faire pour faire varier la force électromotrice et de friction?
- Électromotrice: Ajuster le voltage imposé à notre système
- Friction: Viscosité du milieu
Quel est le gel utilisé pour l’électrophorèse?
Gel de polyacrylamide
À quoi ressemble le gel d’acrylamide par rapport aux protéines?
Un tamis
Où se retrouvent les grosses et les petites protéines sur le gel après l’électrophorèse? Expliquez le principe
Les grosses protéines demeurent dans le haut du gel, dans la zone de largage de l’échantillon tandis que les petites protéines seront plus vers le bas puisqu’ils passent plus facilement à travers le gel
Expliquez pourquoi il est primordial de mettre du sodium dodécyl sulfate (SDS) avant de débuter l’électrophorèse?
Le SDS a comme fonction de charger négativement TOUTES les protéines du milieu. Ainsi, cela permet d’analyser uniquement 1 paramètre soit la taille des protéines. On ne veut pas qu’il y est d’interférence avec les charges en plus puisque nos résultats ne seront pas attribuables à un paramètre.
Expliquez le lien logarithmique entre la distance de migration et le poids moléculaire des protéines. Quelle serait la conclusion quant au pourcentage d’acrylamide?
Une protéine de poids moléculaire faible est plus affectée dans sa distance de migration qu’une protéine de poids moléculaire élevée.
La variation du pourcentage d’acrylamide a un effet plus important sur la résolution des petites protéines que sur les grosses protéines
Pourquoi utilise-t-on le TMB?
Il est le substrat permettant d’obtenir un produit coloré avec les anticorps couplé à la HRP
Qu’est-ce que la HRP? Rôle?
Horse Radish Peroxydase: C’est une enzyme peroxydase qui souvent couplée à un anticorps permet d’émettre de la chemiluminescence afin de voir “indirectement” l’antigène. Le coloration se fait lorsque la peroxydase catalyse une réaction qui forme un produit coloré.
Quel produit permet de dénaturer de façon irréversible et complète les protéines?
Le beta-mercaptoéthanol contenu dans le tampon d’échantillon
Quel est le rôle du TEMED?
Il permet d’activer la polymérisation du gel
Pourquoi doit-on transférer le gel d’acrylamide sur une membrane de nitrocellulose?
Les anticorps se fixent mieux sur la membrane de nitrocellulose que sur le gel d’acrylamide
Pourquoi a-t-on besoin d’utiliser le rouge de Ponceau?
Il permet de donner une aperçu rapide de la présence ou non de protéines
Pourquoi doit-on hybrider la membrane de nitrocellulose avec du lait? Comment s’appelle ce processus?
Les protéines de lait viendront se coller partout sur la membrane où il y a absence de protéines d’intérêt. Ainsi, la résolution est augmenté puisque les anticorps se colleront uniquement sur l’épitope d’intérêt. Il n’y aura pas de faux positifs. C’est l’étape du blocage
Quel est le traitement utilisé pour les cancers hormonaux-dépendants?
Tamoxifène
Qu’arrive-t-il si on utilise le tamoxifène pour un cancer hormonaux-indépendants?
Il ne se passe rien. Le cancer continuera son développement
Quelle est la différence entre les lignées cellulaires
et MCF-7 et MDA-MB-231? Quelle ligne cellulaire est plus maligne?
La lignée MCF-7 contient des récepteurs d’œstrogènes tandis que MDA-MB-231 n’en contient pas. MDA-MB-231 est plus maligne puisqu’elle ne répond pas au traitement antagoniste de ERalpha.
Pourquoi est-ce qu’on utilise un anticorps secondaire et pas juste un anticorps primaire?
L’anticorps secondaire permet d’économiser dans les laboratoires puisqu’il peut reconnaître plusieurs anticorps primaires d’espèces similaires.
Pourquoi est-ce qu’un anticorps secondaire est capable de réagir avec un anticorps primaire?
L’anticorps primaire est injecté à une espèce dans le but qu’elle développe des anticorps secondaires ayant une spécificité contre l’anticorps primaire.
Pourquoi est-ce qu’un anticorps secondaire ne se fixe pas aux protéines déjà sur la membrane et se fixe à l’anticorps secondaire seulement?
L’anticorps secondaire possède une spécificité pour l’anticorps primaire seulement. Pas pour la protéine de la membrane
Qu’arriverait-il si on prenait un anticorps primaire venant de la souris et qu’on utilisait un anticorps secondaire dirigé contre les anticorps de lapin? Est-ce que l’on verrait les mêmes bandes?
On ne verrait pas de bandes. Puisque les anticorps secondaires ne sont pas dirigés contre les bons anticorps primaires. Ainsi, on ne verrait pas de coloration puisqu’il n’y a pas de liaison établie.
Qu’arriverait-il si, dans une expérience de Western Blot utilisant des protéines issues de cellules de souris, on utilisait un anticorps primaire venant de la souris et qu’on utilisait un anticorps secondaire dirigé contre les anticorps de souris? Est-ce qu’on serait capable d’identifier spécifiquement les protéines à l’étude? Quel genre de résultats nous aurions?
Rien (on ne veut pas dénaturer les protéines de l’organisme même, alors il y aura un lien entre l’a-c primaire et secondaire mais comme elle ne peut se lier au prot de souris lors du lavage on va tout retirer)
La technique d’électrophorèse utilisée aujourd’hui fait usage d’un gel à pH discontinu, aussi appelé gel de Laemmli, qui a été inventée en 1970. Pourquoi est-ce important d’avoir un gel de compression et un gel de séparation pour résoudre les protéines lors de l’immunobuvardage? Décrivez aussi le processus biochimique expliquant cette technique?
Le gel de compression permet de concentrer les bandes protéique afin que leur entrée dans le gel de résolution soit facile et que leur séparation subséquente soit distincte. Le gel de résolution est plus polymérisé tandis que le gel de compression est moins polymérisé.
Dans l’expérience que vous venez de faire, est-ce que deux protéines de poids moléculaire différents, mais qui font toute deux partie d’un même complexe protéique dans une cellule, se retrouveraient au même endroit sur la membrane de nitrocellulose?
Non, ils ne se retrouveraient pas au même endroit puisque les complexes sont dénaturés ce qui fait que chaque protéine sera séparé selon son propre poids moléculaire.
Pourquoi utilise-t-on le TRIzol? Quel est son utilité?
Le TRIzol permet de solubiliser le culot de cellules. Il est un inhibiteur des RNases et il permet l’extraction de l’ARN.
Quel est le rôle du Chelex? Pourquoi l’utilise-t-on seulement pour les cellules bactériennes?
Il permet de séquestrer les ions Mg2+ pour inhiber les DNases et les RNases. Il est utilisé uniquement pour les bactéries pour …
Quel est le but d’utiliser le NanoDrop?
Celui-ci permet de calculer la pureté des échantillons d’ARN et d’ADN grâce au ratio d’absorbance de l’ADN et de l’ARN (environ 260 nm) comparé aux autres substances (230 ou 280 nm)
Comment le NanoDrop calcule-t-il la concentration de l’échantillon?
Grâce à la loi de Beer-Lambert qui fait intervenir la longueur du trajet optique qui passe au travers de l’échantillon
Que représente les ratios du NanoDrop? Comment les interprète-t-on?
Les ratios représentent l’absorbance des acides nucléiques par rapport aux contaminants. Si le ratio 260/280 est autour de 2, l’échantillon est pur. Si le ratio 260/230 est autour de 1,8 à 2,2, l’échantillon est pur.
Quelles sont les sources de contamination des échantillons du NanoDrop?
Si le ratio 260/280 n’est pas celui désiré: Présence de protéines, phénol ou d’autres contaminants qui absorbe près de 280 nm.
Si le ratio 260/230 n’est pas celui désiré: Présence de phénol, guanidine, protéines ou glucides (près de 230)
Pourquoi utilise-t-on le SYBR Safe lors des migrations sur gel d’agarose avec des échantillons d’ADN et d’ARN? Il remplace quelle méthode?
Le SYBR Safe est un colorant visible sous lumière UV qui se lie à l’ADN ou à l’ARN par intercalation. Il remplace la technique d’immunobuvardage qui est plus complexe.
L’agarose est retrouvé de façon naturelle dans les:
Algues
Pourquoi n’a-t-on pas besoin de charger les échantillons négativement lors de la migration d’ADN et d’ARN?
Ils sont déjà chargés négativement grâce au groupement phosphate de leur structure. La migration se fera ainsi uniquement en fonction de leur taille.
Quels sont les rôles des ribonucléases?
- Défendre les organismes contre les virus et intrusions génétiques extrinsèques
- Maturation des ARN de l’hôte
- Formation de diverses mécanismes de régulation transcriptionnels (ARNi)
Quels sont les rôles des désoxyribonucléases?
- Brise l’ADN en hydrolysant les liens phosphodiester
- Lutter contre les infections virales
- Segmenter l’ADN au moment de l’apoptose
Pourquoi doit-on chauffer l’agarose avec le TBE 1X?
Il doit y avoir dissolution complète de l’agarose dans le TBE 1X avant de le couler dans le montage
Pourquoi utilise-t-on le TBE pour faire les migrations sur gel d’agarose?
C’est un tampon légèrement basique qui conserve les acides nucléiques chargés négativement. Le TBE contient du EDTA qui est un chélateur. Ainsi, il inhibe les enzymes de dégradation d’acides nucléiques
Permet aussi aux acides nucléiques de bouger dans le gel
Quels sont les ingrédients pour la réalisation du PCR?
- Solution d’ADN à amplifier
- ADN polymérase thermo résistante
- Paire d’amorce d’ADN spécifique
- dNTP (A, T, C, G)
- Machine automatisée de PCR
Que se passe-t-il si on laisse un tube contenant tous les ingrédients du PCR sur le comptoir durant 24h? Expliquez votre raisonnement
Il ne se passera rien. C’est-à-dire qu’il n’y aura pas la chaleur nécessaire afin de dénaturer le double brin d’ADN
Pourquoi doit-on utiliser des amorces d’environ une vingtaine de paires de bases?
On veut avoir la meilleure spécificité possible afin que l’amorce s’attache complètement. Sans quoi, la polymérase ne pourra transcrire le brin d’ADN désiré.
Que veut dire le terme knock-out en génétique?
C’est une espèce qui s’est faite enlevé un gène spécifique. Utiliser pour les études
Quel est le principe général de CRE-loxP?
On insère 2 sites loxP qui servent de promoteurs à la CRE recombinase. Celle-ci pourra donc retirer un gène spécifique de l’animal qui deviendra de type knock-out.
Que signifie le terme “électrophorèse”?
Être transporté par une charge électrique
Quel type d’infection le SDS peut-il causer?
Des affections de la peau (dermatite)
Qu’est-ce que le SDS?
Un détergent et tensioactif ionique fort
Pourquoi faut-il utiliser un milieu semi-liquide plutôt que liquide pour l’électrophorèse SDS-PAGE?
Car dans un milieu liquide, il y a une friction très limitée (NE permet PAS de diriger la migration efficacement)
Dans un milieu semi-liquide, le gel polyacrylamide s’opposera fortement.
Si la concentration d’acrylamine utilisée est élevée dans le gel, qu’est-ce que cela amène?
Le réseau de polymère sera très complexe et les mailles le constituant seront très serrées.
Est-ce les grosses ou les petites molécules qui passent en premier?
Petites
Alors, grosses en haut du gel et petites en bas du gel
Quand utilisons-nous un pourcentage d’acrylamine pour le gel élevé?
Lorsqu’il y a de plus petites protéines.
Est-ce que le SDS est amphiphile?
OUI
Contient une partie hydrophobe ( chaine de carbone) et une partie hydrophile ( Sulfate SO4 2-)
Pourquoi les protéines possèdent-elles des charges négatives ayant une densité de charge comparable ?
Car le SDS est une molécule hautement chargée négativement qui se colle sur les protéines. Cette association permet de rendre négligeable la charge intrinsèque des protéines.
Qu’est-ce que les molécules de SDS (chargées - et affublant toute la protéine) repoussant les unes les autres provoquent?
Un déploiement de la chaine d’acides aminées
Quelle molécule dans le tampon de chargement est capable de réduire les ponts s-s?
Beta-mercaptoéthanol
À quoi sert le tampon de lyse?
Sert à briser les membranes et permet le relâchement des protéines.
Pourquoi le TMB était dans un microtube opaque?
Car il est photosensible, doit être protégé d’une exposition directe au soleil ou d’une source UV
Quelle substance dans le gel est CMR (cancérogène, mutagène et reprotoxique)?
Acrylamide
D’où vient la technique d’immunobuvardage de type Western ?
Émerge d’une modification de la technique inventée par Edwin Southern
De bas en haut, comment fait-on le transfert des protéines sur la membrane nitrocellulose?
- Anode (+)
- Réservoir à ions (papier filtre)
- Membrane
- Gel
- Réservoir à ions (papier filtre)
- Cathode (-)
Quel type de cancer est le plus facile à traiter et pourquoi?
Hormonaux-dépendants, car ils possèdent un récepteur hormonal qui est essentiel pour leur permettre de croitre et qui possible de le bloquer par des antagoniste
Qu’est-ce qu’une hormone pro-proliférative? Donne-moi un exemple.
La présence de l’hormone combinée avec son récepteur va induire la prolifération des cellules. Ex: œstrogène
Qu’est-ce que l’hybridation?
Processus par lequel une sonde trouve sa cible.
Dans la technique de chimioluminescence et de chromogénique, quel est le nom de l’enzyme utilisée?
Peroxydase de raifort (HRP)
Quelle est la principale différence entre la technique chimioluminescence et la chromogénique?
- chimioluminescence : Besoin d’une caméra
- chromogénique : À l’oeil nu
Comment se nomme la technique la plus utilisée pour extraire l’ARN et l’ADN d’une cellule?
L’extraction acide au chlorhydrate de thiocyanate de guanidine, phénol et chloroforme.
Est-ce que le Trizol est sensible à la lumière?
Oui
Quel est l’inhibiteur pour les ribonucléases A (RNAses)?
le TRIzol
Pourquoi faut-il mettre des gants et être vigilant pour l’extraction de l’ARN principalement?
Car les ribonucléases A sont partout (surface de la peau) et cette enzyme est TRÈS résistante à la dénaturation et aux changements de pH
Quelle substance est utilisée afin de protéger les échantillon contre les DNases qui pourraient être encore actifs?
Chelex
Qu’est-ce que l’éluât?
Partie d’une espèce chimique absorbée qui repasse dans la solution. (tube collecteur, ce qui sort de la colonne)
Où retrouverons-nous dans la nature le polysaccaride d’agarose?
Dans les algues
Qu’est-ce que le processus ; intercalation?
L’inclusion réversible d’une molécule entre deux molécules
Quels sont les colorants qui peuvent se lier aux simples brins d’ARN et ADN?
- SYBR Safe
- Le brommure d’éthidium
- SYBR Green
Quelles sont les deux sortes d’enzymes qui s’attaquent aux simples brins?
- Endonucléases
2. Exonucléases
Quel est le rôle des endonucléases?
Les endonucléases s’attaquent à un lien phosphodiester à l’intérieur d’un polynucléotide.
Quel est le rôle des exonucléases?
S’attaquent aux extrémités d’un polynucléotide
Quels sont les rôles des ribonucléases (ARNases)?
- Défendre un organisme contre les virus et les intrusions génétiques extrinsèques
- Un rôle crucial dans la maturation des ARN de l’hôtel et dans la formation de divers mécanismes de régulation transcriptionnels comme les ARNi.
Quels sont les rôles de l’enzyme DNase I?
- Agent de nettoyage cellulaire
- Agit de dégradation ciblée
- Agit d’exécuteur de l’apoptose
Pourquoi les ADN et ARN sont-ils chargés négativement?
À cause du groupement phosphate
Lors de la migration, pourquoi l’ARN passe plus facilement que l’ADN?
Car il est fait d’un seul brin. (J’aurais plus dit parce qu’il possède moins de bases-Ben)
Tout en haut du gel de migration d’ADN et ARN, qu’est-ce que l’on retrouve en haut complètement?
Des chromosomes, car elles sont de grosses molécules, alors plus difficile de passer dans le gel.
Comment se nomme la technique qui amplifie en très grande quantité et en très peu de temps de l’ADN?
PCR
Qu’est-ce que l’amniocentèse?
- Une technique qui consiste à prélever sous échographie, à l’aide d’une fine aiguille introduite dans l’abdomen de la femme enceinte, une petite quantité du liquide amniotique.
- Permet de déterminer la trisomie.
Rôle gel de compression?
Compacter les bandes pour permettre d’observer des bandes distinctes
Rôle gel de compression?
Compacter les bandes pour permettre d’observer des bandes disctinctes
Rôle APS?
(Ammonium persulfate solution)
Catalyse polymérisation du gel
Rôle APS?
Catalyse polymérisation du gel
Pourquoi SYBR safe cancerigene
Car c’est un agent intercalant (mutation dans l’ADN)
Où utiliser le TEMEB?
Sous la hotte
Rôle 2-mercaptoéthanol?
Linéarisation des chaines d’a.a. avec SDS et chauffage (dans tampon chargement)
Rôle 2-mercaptoéthanol?
Linéarisation des chaines d’a.a. avec SDS et chauffage
Quelle gel contient le plus APS?
Le gel de résolution puisqu’il faut séparer de plus petite protéines (donc plus polymériser)
Quelle gel contient le plus APS?
Le gel de résolution puisqu’il faut séparer de plus petite protéines (donc plus polymériser)
Quels sont les ph des gels?
Résolution: 6,8
Compression: 8,8
Pk on enleve le peigne?
Créer les puits
Rôle du tampon de migration?
-Permet la migration des protéines (augmente la conductibilité électrique)
Constituant du tampon de migration?
SDS, Tris, Glycine (-favorise pH 7)
Quel pole est positif et quel pole est negative
cathode: neg
anode: pos
Quel est le sens de la migration?
Cathode (-) vers l’anode (+)
Pk mettre du tampon de transfert?
- Dénaturer les protéines
- Fixe à membrane nitrocellulose
- Améliore efficacité absorption
Que contient le papier filtre?
Réserve d”ions
Rôle PBS?
Nettoyage de la membrane
Rôle Rouge de Ponceau?
Méthode de détection de protéine
Rôle lait en poudre?
Blocage
Rôle tamoxifène?
Remplace estrogène (empêche prolifération)
Pk utilisation anticorps secondaire?
1 type pour plusieurs AC primaire et moins cher pour labo
Pk on fait 3 lavages?
Enlever les anticorps non lié (3 pour efficacité)
À quoi servent les différents temps d’agitation?
Lavage= agitation forte exposition= agitation faible
Pk utilise on un agitateur avec le Chelex?
Éviter que les billes de résine se solidifie
Pk utilise on un agitateur avec le Chelex?
Éviter que les billes de résine se solidifie
Rôle éthanol?
Précipiter ARN
Rôle éthanol?
Précipiter ARN
Pk on utilise des embouts avec filtre?
Pour pas contaminer la pipette (bactérie)
Rôle Élution buffer?
Permet de précipiter l’ADN dans le micro tube (par la colonne)
Rôle Prep buffer?
Récupérer les plus petits et les plus gros ARN
Rôle Wash buffer?
Retirer les contaminants (obtenir uniquement arn/éluat lors tube collecteur)
Similaire au chelex?
EDTA
À quoi servent les endonucléases de restriction?
- À lutter contre des infection virales
- Segmenter l’ADN au moment de l’apoptose
À quoi servent les endonucléases de restriction?
- À lutter contre des infection virales
- Segmenter l’ADN au moment de l’apoptose
Pk MgCl2 dans tampon DNAse?
Magnésium est nécessaire à son activité
Dimension ARNr
Procaryotes: 23S 16S 5S
Eucaryotes: 28S 18S 5,8S 5S
TBE est fait de ?
Tris, Borate, EDTA
échelle 1 Kb est fait à partir
composés de 18 fragments d’ADN purifiés par chromatographie
As-t-on besoin de SDS pour la migration des acides nucléiques?
Non, ils sont déjà négatif
pourquoi on garde tout sur glace
pour ne pas activer les DNases et RNases qui peuvent être actifs avec la chaleur et des ions Mg 2+
sybr safe est un
colorant intercalant
V ou F les fragments d’ADN les plus gros sont les plus bas dans le gel (ils ont plus migrer que les petites molécules)
Absolument faux
Tampon de chargement permet
la coloration lors de la migration
5 ingrédients essentielles pour le PCR
- amorces polymérase dinucléotides machine (pour changement de température) solution qui contient l'ADN
l’Amorce 1 et l’amorce 2 forment des molécules à combien de paires de bases
300 paires de bases
ques que la TAC
adn polymérase Thermo aquaticus
combien d’isoformes pour la protéine Akt
3 isoformes
quels segments sont utilisés pour savoir ou coupé afin d’avoir le segment de l’Akt
les LoxP
quels segments sont utilisés pour savoir ou coupé afin d’avoir le segment de l’Akt
les loxP
la GFP est
Green fluorescent protein (méduse)
ampiciline est un antibiotique de famille des
B-lactamines
b-lactamase :enzyme sécrété par la bactérie: exoenzymes
pétris TSA est
gélose trypto-caséine soja ou gélose trypticase
Nbr nucléotides dans un amorce
20
Pk le test d’oxydase n’a pas bien fonctionné
On avait des vieilles bactéries donc elles ne réagissaient pas bien
