Examen final (labo 5 à 12) Flashcards
Quel est le paramètre permettant de séparer les protéines dans le SDS-PAGE?
Leur poids moléculaire
Quels sont les 2 forces en jeu lors d’un SDS-PAGE?
- Force électromotrice
- Force de friction
Que doit-on faire pour faire varier la force électromotrice et de friction?
- Électromotrice: Ajuster le voltage imposé à notre système
- Friction: Viscosité du milieu
Quel est le gel utilisé pour l’électrophorèse?
Gel de polyacrylamide
À quoi ressemble le gel d’acrylamide par rapport aux protéines?
Un tamis
Où se retrouvent les grosses et les petites protéines sur le gel après l’électrophorèse? Expliquez le principe
Les grosses protéines demeurent dans le haut du gel, dans la zone de largage de l’échantillon tandis que les petites protéines seront plus vers le bas puisqu’ils passent plus facilement à travers le gel
Expliquez pourquoi il est primordial de mettre du sodium dodécyl sulfate (SDS) avant de débuter l’électrophorèse?
Le SDS a comme fonction de charger négativement TOUTES les protéines du milieu. Ainsi, cela permet d’analyser uniquement 1 paramètre soit la taille des protéines. On ne veut pas qu’il y est d’interférence avec les charges en plus puisque nos résultats ne seront pas attribuables à un paramètre.
Expliquez le lien logarithmique entre la distance de migration et le poids moléculaire des protéines. Quelle serait la conclusion quant au pourcentage d’acrylamide?
Une protéine de poids moléculaire faible est plus affectée dans sa distance de migration qu’une protéine de poids moléculaire élevée.
La variation du pourcentage d’acrylamide a un effet plus important sur la résolution des petites protéines que sur les grosses protéines
Pourquoi utilise-t-on le TMB?
Il est le substrat permettant d’obtenir un produit coloré avec les anticorps couplé à la HRP
Qu’est-ce que la HRP? Rôle?
Horse Radish Peroxydase: C’est une enzyme peroxydase qui souvent couplée à un anticorps permet d’émettre de la chemiluminescence afin de voir “indirectement” l’antigène. Le coloration se fait lorsque la peroxydase catalyse une réaction qui forme un produit coloré.
Quel produit permet de dénaturer de façon irréversible et complète les protéines?
Le beta-mercaptoéthanol contenu dans le tampon d’échantillon
Quel est le rôle du TEMED?
Il permet d’activer la polymérisation du gel
Pourquoi doit-on transférer le gel d’acrylamide sur une membrane de nitrocellulose?
Les anticorps se fixent mieux sur la membrane de nitrocellulose que sur le gel d’acrylamide
Pourquoi a-t-on besoin d’utiliser le rouge de Ponceau?
Il permet de donner une aperçu rapide de la présence ou non de protéines
Pourquoi doit-on hybrider la membrane de nitrocellulose avec du lait? Comment s’appelle ce processus?
Les protéines de lait viendront se coller partout sur la membrane où il y a absence de protéines d’intérêt. Ainsi, la résolution est augmenté puisque les anticorps se colleront uniquement sur l’épitope d’intérêt. Il n’y aura pas de faux positifs. C’est l’étape du blocage
Quel est le traitement utilisé pour les cancers hormonaux-dépendants?
Tamoxifène
Qu’arrive-t-il si on utilise le tamoxifène pour un cancer hormonaux-indépendants?
Il ne se passe rien. Le cancer continuera son développement
Quelle est la différence entre les lignées cellulaires
et MCF-7 et MDA-MB-231? Quelle ligne cellulaire est plus maligne?
La lignée MCF-7 contient des récepteurs d’œstrogènes tandis que MDA-MB-231 n’en contient pas. MDA-MB-231 est plus maligne puisqu’elle ne répond pas au traitement antagoniste de ERalpha.
Pourquoi est-ce qu’on utilise un anticorps secondaire et pas juste un anticorps primaire?
L’anticorps secondaire permet d’économiser dans les laboratoires puisqu’il peut reconnaître plusieurs anticorps primaires d’espèces similaires.
Pourquoi est-ce qu’un anticorps secondaire est capable de réagir avec un anticorps primaire?
L’anticorps primaire est injecté à une espèce dans le but qu’elle développe des anticorps secondaires ayant une spécificité contre l’anticorps primaire.
Pourquoi est-ce qu’un anticorps secondaire ne se fixe pas aux protéines déjà sur la membrane et se fixe à l’anticorps secondaire seulement?
L’anticorps secondaire possède une spécificité pour l’anticorps primaire seulement. Pas pour la protéine de la membrane
Qu’arriverait-il si on prenait un anticorps primaire venant de la souris et qu’on utilisait un anticorps secondaire dirigé contre les anticorps de lapin? Est-ce que l’on verrait les mêmes bandes?
On ne verrait pas de bandes. Puisque les anticorps secondaires ne sont pas dirigés contre les bons anticorps primaires. Ainsi, on ne verrait pas de coloration puisqu’il n’y a pas de liaison établie.
Qu’arriverait-il si, dans une expérience de Western Blot utilisant des protéines issues de cellules de souris, on utilisait un anticorps primaire venant de la souris et qu’on utilisait un anticorps secondaire dirigé contre les anticorps de souris? Est-ce qu’on serait capable d’identifier spécifiquement les protéines à l’étude? Quel genre de résultats nous aurions?
Rien (on ne veut pas dénaturer les protéines de l’organisme même, alors il y aura un lien entre l’a-c primaire et secondaire mais comme elle ne peut se lier au prot de souris lors du lavage on va tout retirer)
La technique d’électrophorèse utilisée aujourd’hui fait usage d’un gel à pH discontinu, aussi appelé gel de Laemmli, qui a été inventée en 1970. Pourquoi est-ce important d’avoir un gel de compression et un gel de séparation pour résoudre les protéines lors de l’immunobuvardage? Décrivez aussi le processus biochimique expliquant cette technique?
Le gel de compression permet de concentrer les bandes protéique afin que leur entrée dans le gel de résolution soit facile et que leur séparation subséquente soit distincte. Le gel de résolution est plus polymérisé tandis que le gel de compression est moins polymérisé.
Dans l’expérience que vous venez de faire, est-ce que deux protéines de poids moléculaire différents, mais qui font toute deux partie d’un même complexe protéique dans une cellule, se retrouveraient au même endroit sur la membrane de nitrocellulose?
Non, ils ne se retrouveraient pas au même endroit puisque les complexes sont dénaturés ce qui fait que chaque protéine sera séparé selon son propre poids moléculaire.
Pourquoi utilise-t-on le TRIzol? Quel est son utilité?
Le TRIzol permet de solubiliser le culot de cellules. Il est un inhibiteur des RNases et il permet l’extraction de l’ARN.
Quel est le rôle du Chelex? Pourquoi l’utilise-t-on seulement pour les cellules bactériennes?
Il permet de séquestrer les ions Mg2+ pour inhiber les DNases et les RNases. Il est utilisé uniquement pour les bactéries pour …
Quel est le but d’utiliser le NanoDrop?
Celui-ci permet de calculer la pureté des échantillons d’ARN et d’ADN grâce au ratio d’absorbance de l’ADN et de l’ARN (environ 260 nm) comparé aux autres substances (230 ou 280 nm)
Comment le NanoDrop calcule-t-il la concentration de l’échantillon?
Grâce à la loi de Beer-Lambert qui fait intervenir la longueur du trajet optique qui passe au travers de l’échantillon
Que représente les ratios du NanoDrop? Comment les interprète-t-on?
Les ratios représentent l’absorbance des acides nucléiques par rapport aux contaminants. Si le ratio 260/280 est autour de 2, l’échantillon est pur. Si le ratio 260/230 est autour de 1,8 à 2,2, l’échantillon est pur.
Quelles sont les sources de contamination des échantillons du NanoDrop?
Si le ratio 260/280 n’est pas celui désiré: Présence de protéines, phénol ou d’autres contaminants qui absorbe près de 280 nm.
Si le ratio 260/230 n’est pas celui désiré: Présence de phénol, guanidine, protéines ou glucides (près de 230)
Pourquoi utilise-t-on le SYBR Safe lors des migrations sur gel d’agarose avec des échantillons d’ADN et d’ARN? Il remplace quelle méthode?
Le SYBR Safe est un colorant visible sous lumière UV qui se lie à l’ADN ou à l’ARN par intercalation. Il remplace la technique d’immunobuvardage qui est plus complexe.
L’agarose est retrouvé de façon naturelle dans les:
Algues
Pourquoi n’a-t-on pas besoin de charger les échantillons négativement lors de la migration d’ADN et d’ARN?
Ils sont déjà chargés négativement grâce au groupement phosphate de leur structure. La migration se fera ainsi uniquement en fonction de leur taille.
Quels sont les rôles des ribonucléases?
- Défendre les organismes contre les virus et intrusions génétiques extrinsèques
- Maturation des ARN de l’hôte
- Formation de diverses mécanismes de régulation transcriptionnels (ARNi)
Quels sont les rôles des désoxyribonucléases?
- Brise l’ADN en hydrolysant les liens phosphodiester
- Lutter contre les infections virales
- Segmenter l’ADN au moment de l’apoptose
Pourquoi doit-on chauffer l’agarose avec le TBE 1X?
Il doit y avoir dissolution complète de l’agarose dans le TBE 1X avant de le couler dans le montage
Pourquoi utilise-t-on le TBE pour faire les migrations sur gel d’agarose?
C’est un tampon légèrement basique qui conserve les acides nucléiques chargés négativement. Le TBE contient du EDTA qui est un chélateur. Ainsi, il inhibe les enzymes de dégradation d’acides nucléiques
Permet aussi aux acides nucléiques de bouger dans le gel
Quels sont les ingrédients pour la réalisation du PCR?
- Solution d’ADN à amplifier
- ADN polymérase thermo résistante
- Paire d’amorce d’ADN spécifique
- dNTP (A, T, C, G)
- Machine automatisée de PCR
Que se passe-t-il si on laisse un tube contenant tous les ingrédients du PCR sur le comptoir durant 24h? Expliquez votre raisonnement
Il ne se passera rien. C’est-à-dire qu’il n’y aura pas la chaleur nécessaire afin de dénaturer le double brin d’ADN
Pourquoi doit-on utiliser des amorces d’environ une vingtaine de paires de bases?
On veut avoir la meilleure spécificité possible afin que l’amorce s’attache complètement. Sans quoi, la polymérase ne pourra transcrire le brin d’ADN désiré.
Que veut dire le terme knock-out en génétique?
C’est une espèce qui s’est faite enlevé un gène spécifique. Utiliser pour les études
Quel est le principe général de CRE-loxP?
On insère 2 sites loxP qui servent de promoteurs à la CRE recombinase. Celle-ci pourra donc retirer un gène spécifique de l’animal qui deviendra de type knock-out.
Que signifie le terme “électrophorèse”?
Être transporté par une charge électrique
Quel type d’infection le SDS peut-il causer?
Des affections de la peau (dermatite)
Qu’est-ce que le SDS?
Un détergent et tensioactif ionique fort
Pourquoi faut-il utiliser un milieu semi-liquide plutôt que liquide pour l’électrophorèse SDS-PAGE?
Car dans un milieu liquide, il y a une friction très limitée (NE permet PAS de diriger la migration efficacement)
Dans un milieu semi-liquide, le gel polyacrylamide s’opposera fortement.
Si la concentration d’acrylamine utilisée est élevée dans le gel, qu’est-ce que cela amène?
Le réseau de polymère sera très complexe et les mailles le constituant seront très serrées.
Est-ce les grosses ou les petites molécules qui passent en premier?
Petites
Alors, grosses en haut du gel et petites en bas du gel
Quand utilisons-nous un pourcentage d’acrylamine pour le gel élevé?
Lorsqu’il y a de plus petites protéines.
Est-ce que le SDS est amphiphile?
OUI
Contient une partie hydrophobe ( chaine de carbone) et une partie hydrophile ( Sulfate SO4 2-)
Pourquoi les protéines possèdent-elles des charges négatives ayant une densité de charge comparable ?
Car le SDS est une molécule hautement chargée négativement qui se colle sur les protéines. Cette association permet de rendre négligeable la charge intrinsèque des protéines.
Qu’est-ce que les molécules de SDS (chargées - et affublant toute la protéine) repoussant les unes les autres provoquent?
Un déploiement de la chaine d’acides aminées
Quelle molécule dans le tampon de chargement est capable de réduire les ponts s-s?
Beta-mercaptoéthanol
À quoi sert le tampon de lyse?
Sert à briser les membranes et permet le relâchement des protéines.
