Examen Final Bio Biotechnologie Flashcards
But de la biotechnologie
Introduire de l’ADN étranger dans un organisme afin d’étudier/récolter/produire de l’ADN/ARN/protéine
Étapes principales pour arriver au but de la biotechnologie (6)
- Choix de l’organisme selon le but finale
- Choix du vecteur
- Choix de la technique d’insertion du vecteur dans l’organisme
- Sélection du clone contenant le gène
- Étude du système d’expression
- Le but: ADN/ARNm/protéine
Qu’est-ce qu’un système d’expression
Par exemple une bactérie qui a un plasmide avec un ADN recombinant
Qu’est-ce qu’un ADN recombinant
L’ensemble formé par un vecteur et ses fragments insérés d’ADN
Les 6 étapes pour faire de l’ADN recombinant
- Couper l’ADN de l’organisme donneur
- Insertion dans un vecteur
- Insertion du vecteur dans une bactérie
- Sélection du recombinant
- Multiplication du recombinant
- Production de protéine/ recherche fondamentale du gène et/ou de la protéine/ OGM
Qu’est-ce qu’une enzyme de restriction
Enzymes naturellement présentes chez les bactéries qui les protègent contre l’ADN étranger
Spécifique à une séquence précise de nucléotides
Utilité d’une enzyme de restriction
Coupe le génome des bactériophages (ADN)
Particularité des enzymes de restriction
Palindromes
Nommer les 2 types d’extrémité des enzymes de restriction
Franche
Cohésive: coller 2 liaisons hydrogènes entre les 2 ADN
À quoi sert l’ADN ligase
Relier les bouts d’ADN
Les nucléotides des extrémités cohésives s’associent par …
Par liaisons hydrogènes
Par complémentarité des bases
Différence entre extrémités cohésives et franches
Toutes les franches sont compatible entre elle (avantage)
Cohésive doit trouver LA bonne séquence
Franche plus difficile à lier, - efficace
Meilleure choix entre franche et cohésive?
Cohésive
À quoi servent les vecteurs de clonage
Permettent d’insérer un gène étranger dans un organisme pour cloner des banque génomiques ou d’ADN complémentaire ou encore pour cloner gènes spécifiques
3 caractéristiques des vecteurs
Manipulation facile (petite molécule) Réplication efficace dans une cellule vivante Présence de sites de restriction
Caractéristique d’une banque génomique ou d’ADNc
Production de milliers de clones
Ne vise aucun gène en particulier
Caractéristique de gènes spécifiques
Formation d’une banque et criblage (identification de gènes)
Insertion du gène spécifique directement dans le vecteur (produit PCR digéré par enzyme de restriction)
Nommer 3 vecteurs de clonage
Plasmide
Phage
Chromosome bactérien artificiel
Les vecteurs plasmidiques possèdent…
Gènes de résistance (antibiotiques pour éviter que la bactérie se débarrasse du plasmide)
Sites de restriction spécifique
Quantité ADN cloné avec plasmide
10kb
Quantité ADN cloné avec phage
15kb
Avantages de prendre vecteur phagique
Facilement stockées et manipulées
Contient + d’ADN
Étapes vecteur phagique (6)
- Digestion de l’ADN génomique du donneur (couper avec enzyme de restriction)
- Digestion de l’ADN phagique
- Liaison de l’ADN recombinant (ADN ligase)
- Mélange in vitro de l’ADN et des composantes phagiques
- Formation de phages spontanément
- Étalement sur des bactéries sensibles
Qu’est-ce qu’un BAC
Chromosome bactérien artificiel
Gros plasmide dont la majorité des gènes ont été retirés
Seuls les gènes responsables de réplication autonome ont été conservés
Avantage d’utiliser un BAC
Très utile pour constituer les banques génomiques
Quantité ADN cloné avec BAC
100 à 300kb
Particularité avec les gènes eucaryotes dans un organisme étranger (3)
- Reconnaissance du promoteur eucaryote
- Présence d’introns
- Modification de l’ADNm et de la protéine
Conséquence de la reconnaissance du promoteur eucaryote (particularité avec gène)
Pas de promoteur, alors pas d’ARN pol, alors pas ADN et pas de protéine
Conséquences de la présence d’intron (particularité avec gène eucaryote)
On doit enlever introns sinon codera pas la bonne protéine (trop grand, alors pas bonne séquence)
Conséquence de modification de l’ARNm et de la protéine (particularité avec gène eucaryote)
Modification post-transcriptionnelle
Les bactéries ne sont pas capables de faire ses modifications là
3 solutions pour exprimer gène eucaryote dans bactérie
Composition du vecteur d’expression bactérien
Utilisation d’ADNc en guise de gène
Utilisation d’un organisme eucaryote
Solution 1: Composition du vecteur d’expression bactérien
Problème: reconnait pas le promoteur
Solution: changer le promoteur (couper et coller nouveau)
MCS, il y a un promoteur bactérien juste en avant
Le promoteur bactérien permet l’expression et la contrôle
Exemple de promoteur bactérien
pGal, pBad (promoteur d’opéron de sucre, lactose, arabinose)
Hautement actif, très efficace, indicible en présence ou non de sucre
Solution 3: Utilisation d’un organisme eucaryote
Nommer les 4 organismes qui peuvent être utilisé
Levure
Oeuf fécondé,
Cellules animales ou végétales
Organisme végétal (OGM)
Levure
Organisme unicellulaire
Croissance rapide, utilisation facile, plasmide compatible avec certaines bactéries
800kb
YAC (yeast artificial chromosome) plasmide peut être modifié en chromo eucaryote (linéaire = chromo, rond = plasmide)
Reconnaissance promoteur et intron
Oeuf fécondé
Ovule, zygote, embryon
Micro-injection dans les cellules animales
Efficace pour souris, lapin, mouton, porc
3 à 10% efficacité
Injection ADN
Cellules animales ou végétales
Culture cellulaire in vitro
Transformation par électroporation pour faire transformation
Canon à gène (bombarder cellule végétale)
Plus rapide que choc thermique, le choc permet à l’ADN de rentrer
Identification de clones
4 étapes
Utiliser une sonde nucléique
15-20 nucléotides qui va détecter ce que tu cherches (quel clone a l’ADN qu’on veut)
1. Plaques multipliés qui contient tous les clones
2. Transférer tes clones sur membrane de nylon
3. Membrane de nylon dans ziploc, hybridé avec sonde
4. Identifier le clone qui est hybridé avec la sonde (fluorescent)
Cloner le gène est la première étape vers…
Une étude plus approfondie de la structure et de la fonction du gène
La création d’un système d’expression du gène (protéine codée)
Qu’est-ce qu’un système d’expression
Organisme + ADN recombinant (vecteur + gène d’intérêt)
But de l’étude des systèmes d’expression
Exprimer un gène (ARNm et/ou protéine)
Qu’est-ce que le séquençage
C’est l’obtention de la séquence nucléotidique d’un gène et est souvent la suite logique de l’étude de celui-ci
Qu’est-ce qu’une carte génomique
Séquençage de génome complet d’un organisme
À quoi sert le séquençage
Comparer la séquence de pleins d’organisme
Vérifier la présence de mutation dans le gène dans un système d’expression
Nommer 4 techniques visant l’ADN
Séquençage
PCR
STR/PTFR
Buvardage de Southern
Nommer 3 techniques visant l’ARNm
Buvardage de Northern
RT-PCR
Biopuces ou tests sur microréseau à ADN
Nommer 2 techniques visant la protéine
SDS-PAGE
Immunobuvardage de Western
Qu’est-ce que le PCR
Synthétise des amorces spécifiques et on amplifie ce gène d’intérêt par la méthode du PCR (amplification chaine d’ADN par polymérase in vitro)
Quand est-il possible d’utiliser la technique de PCR
Quand la séquence d’ADN est connue
Pourquoi le PCR est une bonne technique
Fais des milliards de copies en quelques heures
C’est une percée biologique comparable au microscope (permet de visualiser l’ADN)
De quoi avons-nous besoin pour polymérise un nouveau brin d’ADN (PCR)
ADN standard
Nucléotide (désoxyribonucléotides pour fabriquer de l’ADN)
Polymérase (ADN pol ADN dép) TAQ
Amorces (chaine de nucléotides)
À quoi sert les amorces
Permet à la TAQ de s’accrocher, déterminer la section à amplifier
Température TAQ travaille et résiste
Travaille à 75 et résiste à 99
Nom de l’appareil pour faire PCR
Thermocycleur
Nommer les températures pour le PCR (dans l’ordre)
90
environ 55
75
Cycle de réplication PCR à 90
Étape 1: Dénaturation
Tellement de mouvement que les brins se séparent (liens H) pour que les amorces se collent
Ne dégrade pas l’enzyme
Cycle de réplication PCR à 55
Étape 2: Hybridation
Moins de mouvement, alors les amorces peuvent se coller aux nucléotides
Pourquoi ce n’est pas toujours la même température à l’étape 2 (PCR)
Dépends des amorces (le % en GC)
Bcp de GC = haute température
Que se passe t-il si la température à l’étape 2 est trop basse (PCR)
L’amorce se colle n’importe où
19/20 nucléotides et on veut 20/20
Cycle de réplication PCR à 75
Étape 3: Élongation
Polymérase arrive (température active TAQ)
Avance sur double brin (amorce + simple brin)
Polymérise le brin d’ADN
Cycle se répète 40x
Quelle est la longueur de l’ADN qui est fabriqué (PCR)
Entre les deux amorces
Comment peut-on vérifier la technique de PCR
Avec électrophorèse sur gel d’agarose
À quoi sert l’électrophorèse sur gel d’agarose
Séparer les molécules d’ADN selon leur longueur
Visualiser l’ADN
4 étapes de l’électrophorèse sur gel d’agarose
- Les fragments d’ADN sont placés dans un gel d’agarose
- Le gel est soumis à un courant électrique
- Les molécules d’ADN sont naturellement chargées négativement
- Plus les molécules d’ADN sont courtes, plus elles avancent rapidement
À quoi sert STR/PTFR
Analyser les allèles dans une région connue
STR définition et vrai nom
Short tandem repeat
Possède une longueur variable dans la population due à la répétition d’une courte séquence d’ADN
Combien avons nous d’allèle
2
Étapes pour STR
- Amplification d’un segment d’ADN (PCR)
2. Migration sur gel d’électrophorèse
PTFR vrai nom
3 étapes
Polymorphisme de taille des fragments de restriction
- Amplification d’un segment d’ADN (PCR)
- Digestion avec enzyme de restriction
- Migration sur gel d’électrophorèse
À quoi sert PTFR
Comparer le patron de digestion
Il est différent, mais même longueur
Différence entre PTFR et STR
STR Longueur PTFR Nature (site action enzyme de restriction)
Pourquoi on n’analyse pas le génome complet avec l’électrophorèse
Nombre de fragments beaucoup trop important même si le génome complet peut être digéré par des enzymes de restriction
Comment fonctionne le buvardage de Southern (les étapes)
- Digérer le génome complet avec enzyme de restriction
- Séparer par électrophorèse
- Transfert l’ADN sur la membrane de nylon
- Hybride avec la sonde d’ADN complémentaire
- Détecte (fluo ou x-ray)
Southern, Northern, Westhern
Southern ADN
Northern ARN
Westhern protéine
Pourquoi vérifier la présence d’ARNm après avoir cloné un gène
Pour vérifier que le gène est présent et s’il est exprimé (il s’est transcrit)
Informations que donnent l’ARNm comparativement à l’ADN
ADN Tous les gènes que tu possèdent
ARNm Tous les gènes transcrits (gènes utilisés à ce moment là et de quoi ta cellule a besoin à ce moment là)
RT-PCR
Reverse transcriptase
Plus rapide et plus spécifique que le buvardage de Northern
On cible l’ARNm d’un seul gène
4 étapes de RT-PCR
- Isoler l’ARNm à différents stades ou conditions
- Transformer l’ARN en ADN avec ADN pol ARN dép (transcriptase inverse)
- Amplification PCR de l’ADNc d’intérêt
- Électrophorèse sur gel d’agarose
(quantité, intensité relative (production ARNm) bande plus ou moins brillante)
Solution 2: Utilisation d’ADNc en guise de gène
Problème: enlever intro
Solution: prendre transcriptase inverse
On prend ARNm (pas l’ARNprém qui a les introns) et on fait RT
On obtiens de l’ADN double brin qui est ADNc
Pourquoi faut-il prendre ADNc au lieu ADN standard
2 raisons
- Enlever les introns
- Régler le problème de % de GC
Mutation silencieuse pour ajuster % GC (code pour le même acide aminé) chaque espèce a des codons préférés (ARN transfert ce codon là alors meilleur rendement pour protéine)
Différence entre banque génomique et banque d’ADNc
Banque génomique: TOUT le génome, junk ADN
Banque ADNc: Gènes exprimés dans les conditions actuelles (quelles protéines la cellule a besoin)
Organisme végétal (OGM)
Étapes
Porter un gène d’intérêt à l’intérieur d’une plante avec bactérie
- Couper plasmide Ti avec enzyme de restriction
- Mettre gène d’intérêt (fait ADN recombinant)
- Mettre plasmide en contact avec plante (cellule abimée)
- Plasmide envoie son ADN et il va s’intégrer au génome
Les biopuces ou tests sur microréseau à ADN
Utilise une amorce spécifique par gène déposée sur une lame de verre
Hybridation d’ADN récolté
- ADNc (voir niveau d’expression des gènes)
- ADN génomique (détection présence d’un ou plusieurs gènes spécifiques)
Utilisation de marqueurs fluorescents
SDS-PAGE vrai nom et étapes
Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
- Traitement des protéines: dénaturation et ajout de charge négatives (linéarisé la protéine)
- Migration de protéine sur un gel de polyacrylamide grâce à courant électrique
- Les plus petites vont les plus vites
Immunobuvardage de Wester
Le gel de polyacrylamide est transféré sur une membrane
Hybridation avec des anticorps spécifiques à la protéine recherchée
Qu’est-ce que sont des cellules souches
Cellule qui peuvent devenir n’importe quel autre type de cellule
2 types de cellules souches
Totipotente: Toute (cellule pas différenciée, cellule souche embryonnaire)
Pluripotente: Plusieurs (moelle osseuse devient leucocyte ou eurycocyte)
Différences et ressemblance entre cellule différenciée et souche
Ressemblance: ADN est pareil
Différence: Régulation est différente (chromatine, compaction)
Provenance des cellules souches et problèmes
Adultes (juste pluripotente)
Pluripotente induite (traiter adultes)
SE d’embryons congelés (éthique)
Définition thérapie génétique
Insérer un allèle normal dans les cellules somatiques des tissus affectés par mutation
Cellules se reproduisent avec le bon gène et guérison du patient (plus ou moins)
Mettre bon gène dans rétrovirus
Rétrovirus injecte le bon gène dans ADN
Avec quoi fait-on de la thérapie génétique
Un rétrovirus, car il délivre le gène dans l’ADN en s’intégrant
Risque thérapie génétique
On ne sait pas où s’insère le gène (milieu gène important, inactif ou peut réactivé une section inactive)
Mode d’action thérapie génique classique (AHF)
- Lentivirus introduit le gène dans l’hémoglobine
- Prélève les cellules souches du patient
- Mise en contact des cellules avec le virus
- Destruction de la moelle osseuse
- Réinjection par voie sanguine des cellules souches modifiés
3 composantes de CRISPR-Cas9
- ARN guide (dire jusqu’à où couper)
- ADN corrigé à introduire
- Enzyme effectuant le clivage et le remplacement
CRISPR-Cas9
Réparer gène et inactivé mauvais gène (introduire codon stop)
Insérer ADN où on veut
Mode d’action CRISPR-Cas9 (AHF)
- Destruction moelle osseuse chez patient
- CRISPR-Cas9 sur cellule en culture
- Vérifie chaque cellule sur séquenceur à haut débit
- Sélection de la cellule corrigée
- Multiplie en culture
- Transfert au patient
