Examen 2 Flashcards
V/F
Il est impossible d’effectuer le marquage d’une sonde à l’aide de la DIG-11-dUTP sans la présence d’une ADN polymérase.
FAUX
ex : terminale transferase et ARN polymérase
V/F
Le gène tk utilisé dans la construction du vecteur d’expression pour la fabrication d’une souris «knock-out» sert à conférer une sensibilité à un antiviral ce qui permet la destruction des cellules ayant incorporé ce gène.
VRAI
Donne la sensibilité au ganciclovir (antiviral)
* Sans tk = rien
analogue de base phosphorylé (par tk) est incorporé et arrête la polymérisation
V/F
Le SYBR Green est une molécule intercalante qui sert à visualiser l’ADN lorsque excitée avec une lumière UV
VRAI
V/F
Le marquage d’une sonde à l’aide de la DIG-11-UTP est plus spécifique que le marquage radioactif à l’aide du 32P-dCTP
FAUX
Il y en a un de radioactif et l’autre fluo (2 drapeaux)
*pas de différence de spécificité… c’est un nucléotide comme un autre
V/F
Lors d’une électrophorèse, l’ADN et les protéines migrent toujours du pôle négatif vers le pôle positif.
VRAI
*ADN et protéines chargés positivement
V/F
Les RFLP n’ont généralement aucune fonction biologique
VRAI
Juste un endroit dans le génome (marqueur moléculaire) qu’on trouve/utilise - qui donne un portrait génétique d’une famille.
Au cours de la fabrication d’une souris transgénique «knock-out»
a) il y a 3 possibilités du devenir de notre vecteur étranger dans le génome de la cellule souche
b) toutes les cellules de la souris transénique «knock-out» seront transformées à la suite de la réintroduction des cellules souches dans le bouton embryonnaire du blastocyste
c) la recombinaison homologue n’est pas nécessaire puisque l’ADN étranger peut s’insérer de façon non spécifique et aléatoire dans le génome de l’hôte
d) les souris chimères sont toutes homozygotes
A
on cherche la recombinaison homologue - c’est ce que l’on sélectionne
Combien faut-il d’amorce(s) d’ADN différentes pour effectuer l’amplification d’un fragment d’ADN par la méthode du PCR ?
2
Dans la solution de préhybridation au cours de la méthode de Southern ou Northern lequel de ingrédient ci-dessous est absent ?
a) ADN exogène en excès tel que l’ADN de sperme de saumon
b) des sels
c) des agents dénaturants comme la formamide/formaldéhyde
d) des sondes d’ADN marquées
e) toutes ces réponses
D
Dans la thérapie germinale :
a) on injecte un transgène dans un oeuf fécondé
b) une cellule transgénique est injectée dans un embryon au stade blastocyste
c) le transgène injecté se retrouve dans toutes les cellules de l’animal transgénique
d) l’animal transgénique produit est une chimère composée de cellules non-transgéniques et transgénique
B et D
thérapie germinale = directement dans l’ovule
Expliquer comment faire le marquage d’une sonde en 3’ pour qu’il y ait ajout d’un seul nucléotide
ddNTP - nucléotide didéoxy (méthode de Sanger)
-OH absent
terminal transférase
Combien de nucléotides minimaux une sonde doit être pour être complémentaire à 100% seulement 1 fois dans l’ADN ?
20 nucléo
Pourquoi chauffe t-on l’ADN ?
Pour le dénaturer - le rendre simple-brin
Comment fixe-t-on l’ADN pour l’empêcher de se réhybrider après qu’il est été chauffé ?
Fixation aux UV *peut causer des mutations (crosslinked)
Ou choc termique (bain glace)
Qu’est-ce que la stringence ?
Permet de réguler l’hybridation - augmenté ou réduire complémentarité non totale (homologie)
Qu’est-ce qu’un faux positif ?
Hybridation d’une sonde avec de l’ADN avec moins de 100% d’homologie
Est-ce qu’une concentration saline élevée aide l’hybridation d’ADN ?
OUI
aime solution saline - SSC
Comment fait-on pour empêcher la fixation des ADN à la membrane ?
Bloquage par ADN exogène dans la solution de pré-hybridation
Pourquoi utilise-t-on le sperme de saumon ?
Peu coûteux
Accessible
pour bloquer la membrane
au niveau de l’origine (ATGC) des nucléotides, qu’est-ce qui peut influencer une forte hybridation ?
% GC (3 liens) = donne solidité = plus dur de séparer les 2 brins
comment augmente-t-on la stringence ?
baisse concentration saline
augmentation de la température
Qu’est-ce que fait une diminution de la stringence ?
plus de faux positif
aide sonde à s’hybrider (même avec moins d’homologie)
Pourquoi utiliserait-on une diminution de stringence ?
Quand on cherche des gènes humains qui ressemblent à des gènes trouvés dans un autre organisme
Qu’est-ce que du DIG-11-UTP ?
Drapeau sur chaque U ou T
*dioxygénine reconnue par un anticorps
Quel indicateur est plus stable entre le DIG-11-UTP et le 32P-dCTP ?
DIG-11-UTP
Quelles sont les étapes pour cloner un gène ?
- Dénaturer (95°C) - devient simple-brin
- Fixation (UV ou choc thermique)
- Hybridation amorce (64°C)
- Ajout ADN polymérase - polymérisation à partir de la sonde(marquage aléatoire)
Que fait la Nick translation DNase ?
Fait des trous que l’ADNpoly vient bouché à partir des sondes
*finit pas son travail
Comment peut-on ajouté un seul nucléotide ?
ddNTP : -3’ OH de supprimé (arrêt synthèse - un seul DIG)
Est-ce qu’un seul nucléotide (ddNTP) est suffisant pour voir le signal ?
OUI
Quel gel utilise-t-on pour recevoir l’ADN pour établir la séquence nucléotidique par électrophorèse ?
Gel d’acrylamide (précis au nucléotide près)
Qu’est-ce que la méthode de Sanger ?
Électrophorèse avec 4 puits (ATGC) et ddNTP qui ont arrêté la séquence à différentes places (diff longueur de bout de gène - aléatoire)
Qu’est-ce que le polymorphisme ?
Différence dans la séquence d’ADN du même locus dans deux organismes
Qu’est-ce que le pyroséquençage ?
Ajout de nucléotide un par un et émission de lumière qui apparaît quand le nucléotide est ajouté = on mesure la lumière émise
À quoi sert le pyroséquençage ?
Déterminer la séquence d’ADN
Dans le pyroséquençage, qu’est-ce qui fournit l’énergie pour l’émission de lumière ?
Libération de 2 Phosphates quand il y a liaison à l’ADN
Quelles sont les étapes du PCR ?
- Dénaturation (94°C)
- Annealing/hybridation amorces (55-65°C)
- Polymérisation (72°C)
À quoi servent les adapteurs à bouts francs qu’on colle aux bouts de l’ADN ?
Reconnaissance pour mettre amorce
Qu’est-ce que Q-PCR ?
PCR quantitatif
Qu’est-ce que TaqMan ?
Une amorce de plus (au milieu de l’ADN) = permet d’être quantitatif
*reconnait une séquence à l’intérieur de notre ADN
1 molé d’ADN= 1 molé de lumière
Qu’est-ce que le pyroséquençage ?
Mettre ATGC un par un > lumière qui apparait quand le nucléotide est ajouté = on mesure la lumière émise
Quelle enzyme convertit l’IPP est l’APS en ATP dans le pyroséquencage ?
ATP sulfurylase
Qu’est-ce que l’APS ?
adénosine 5’ phosphosulfate
Que fait la luciférase ?
Prend l’ATP et convertit luciférine en lumière
Que devient la luciférine une fois clivée par la luciférase ?
oxyluciferine
Par quoi la lumière est détectée dans le pyroséquancage ?
CCD - caméra couplée
V/F
La hauteur des pics sur un pyrogramme est proportionnel au nombre de nucléotides incorporés
VRAI
Que fait l’apyrase ?
Dégrade les nucléotide et l’ATP ( fin de la méthode du pyroséquencage)
Avec quoi est incorporé l’ADN d’intérêt (brin) dans la première étape du pyroséquençage ?
ADN polymérase + ATP sulfurylase + luciférase + APS + luciférine + amorce de séquencage
Qu’est-ce que l’ATP sulfurylase ?
enzyme convertit l’IPP est l’APS en ATP dans le pyroséquencage
Comment nomme-t-on la méthode de marquage avec des amorces aléatoires qui déclenche la polymérisation par l’ADNpoly?
Random primed labeling
Est-ce que la séquence d’ADN à besoin d’être connu dans le random primed labeling?
NON
*on veut juste polymériser
Est-ce que l’amorce est connu dans le marquage PCR ?
OUI
Par quelle enzyme se fait la polymérisation dans le marquage PCR?
TAQpolymérase
*résistante à la chaleur
Quel méthode de marquage utilise la DNase ?
Nick translation
*fait trous
Quel méthode de marquage utilise l’ADNpoly ?
Random primed labeling
Quelle est l’enzyme utilisée dans le marquage en 3’ avec ajout de 50 nucléotide ?
Terminale transferase
À quelle extrémité il y a un marquage unique avec ddNTP ?
3’
** par terminale transferase
Quelle méthode de marquage utilise l’ARN?
Sonde d’ARN
Quel est l’avantage de la sonde d’ARN comme marquage ?
Déjà simple-brin (vu que c’est de l’ARN)
> plasmide linéarisé
Nommer les trois méthode de détection après l’hybridation
- Cheluminescence
- Colorimétrie
- Fluorescence
Quels sont les avantages du pyroséquencage ?
+ rapide
besoin d’une seule copie (pas d’amplification)
permet de lire une + longue chaine
Qu’est-ce que la CAS9?
Nucléase
*enlève le gène de façon ++ précise
Nommez les 3 étapes du PCR (amplification/amorce)
1- dénaturation de l’ADN (95°C) pour séparer les brins
2- hybridation des 2 amorces (55-65°C)
3- Polymérisation (72°C)
Si l’on ne connait pas la séquence de l’ADN à amplifier par PCR, comment fait-on pour que les amorces puissent s’y coller ?
Utilisation d’adaptateurs à bouts francs (qu’on connait la séquence) collés à l’ADN qui vont se faire reconnaitre par les amorces
Que fait-on pour éliminer les «premiers» brins de longueurs différentes dans la PCR (non-spécifique qui a été amplifier) ?
Augmentation de la stringence
V/F
à chaque cycle de la PCR, la lumière captée augmente
VRAI
Est-ce que le real-time PCR est un Q-PCR ?
OUI
Qu’est-ce que le RT PCR ?
Reverse transcriptase PCR (pour savoir si un gène est + ou - exprimé)
La courbe d’analyse du RT PCR sera plus haute ou plus basse si le gène analyse est plus exprimé ?
Plus haute
Qu’est-ce que le TAQman ?
Une amorce de plus - permet d’être quantitatif (3 amorces en tout)
> reconnait une séquence à l’intérieur du gène
Qu’est-ce que signifique une seule bande sur électrophorèse après digestion par une enzyme ?
Que c’était un plasmide
Qu’est-ce qu’un RFLP ?
Toute modification des séquences d’ADN (mutation, addition, délétion) qui réorganise les sites de restriction. Lors de l’action d’enzymes de restriction, la taille des fragments de restriction est alors modifiée : on observe un polymorphisme
Est-ce que les RFLP ont une fonction biologique ?
NON
Qu’est-ce qu’un locus ?
Un endroit sur le chromosome (donc 2 copies)
Dans l’étude des RFLP, faut-il tenir compte des exceptions dû à la recombinaison homologue ?
OUI
Quelle est l’enzyme utilisé pendant la PCR ?
Taq polymérase
Qu’est-ce que la génétique classique ?
Partir du phénotype pour trouver un gène
Qu’est-ce que la génétique inverse ?
Créer une mutation (ou knock-out) dans un gène pour savoir à quoi il sert (son phénotype)
Partir du phénotype pour trouver un gène est de la génétique classique ou inverse ?
Classique
Comment fait-on un knock-out ?
Délétion complète du gène ou insertion d’un «drapeau» qu’on peut tracer dans le gène > ce qui l’inactive en même temps
Qu’est-ce que l’IPTG?
ON/OFF qui active le gène du ligand du récepteur T7
Qu’est-ce qui arrive s’il n’y a pas d’IPTG lors d’une production de protéine ?
Devient toxique pour la division cellulaire
* ON/OFF qui permet la régulation de production
À quoi sert un peptide signal lors de la production d’une protéine ?
Mettre TAG spécifique pour reconnaître la protéine p/r aux autres (ou la faire sortir de la bact)
Comment fait-on pour avoir un clonage «orienté»
Utilisation de 2 enzymes de restriction (pour l’orientation du gène)
Qu’est-ce que le système RISC ?
Interfère avec des doubles-brins d’ARN reconnus et les séparent
Quels sont les avantages de l’utilisation de phages pour un insertion de gène (dans de l’ADN) ?
- Permet le transfert d’ADN dans des cell eucaryotes
- Insertion dans le génome (par perdu lors de la division cellulaire) = + stable
Quel est le problème général de la thérapie génique ?
Ce ne sont pas toutes les cellules qui sont infectées
Quelle est la meilleure méthode pour l’insertion d’ADN dans un génome ?
Infection virale (phages)
Quel est la difficulté des BAC ?
C’est gros = difficile de réplication
Que fait-on pour réduire au maximum la taille de l’ADN qu’on insert ?
On réduit le promoteur à sa taille minimale (juste région fonctionnelle)
Nommez un exemple de gène rapporteur
- GFP
- promoteur de choc thermique (ex: avec beta-gal)
Qu’est-ce qu’un promoteur constitutif ?
Exprimé/actif dans toutes les cellules
Qu’est-ce que le gène tk ?
Pour la sélection
*thymisine kinase (ajout P à la thymine)
Qu’est-ce que la technologie TET-ON ?
ON/OFF utilisé par la levure
**prot s’attache sur le promoteur juste quand elle lie la doxycycline
Est-ce qu’il y a des télomères dans le Yeast artificial chromosome ?
OUI
Comment fait-on pour déterminer la section régulatrice d’un promoteur ?
Manipulation de sa région régulatrice (par délétion) in vitro
Quels sont les organismes les plus utilisés pour le génie génétique ?
Caenorhabditis elegans, drosophile et souris
Quelles sont les 3 possibilités d’insertion d’un gène ?
- Rien - pas d’insertion
- Insertion mais pas à la bonne place
- Recombinaison homologue (insertion à la bonne place)
Comment sépare-t-on les génomes qui ont inséré l’ADN d’intérêt de ceux qui ne l’ont pas fait ?
Insertion préalable d’un gène de résistance à un antibiotique avec l’ADN qu’on à inséré
> quand on met l’antibiotique en contact = juste ceux qui ont insérés l’ADN d’intérêt résisteront
Comment sépare-t-on les génomes qui ont inséré l’ADN d’intérêt à la bonne place recombinaison homologue de ceux qui ne l’ont pas fait ?
Insertion de TK (thymine kinase qui phosphoryle) aux extrémité - et inséré dans le génome par la polymérase (vont rester sur le gène original lors de la recombinaison homologue = absent sur les cellules qui auront inséré l’ADN correctement)
> Ajout de Ganciclovir (antiviral)
Ganciclovir = inactif si non phosphorylé par TK
donc seulement les cellules ayant du TK vont être tuées par le ganciclovir
Qu’est-ce que du Ganciclovir ?
Un antiviral
Dans quoi sont insérés les cellules qui ont résisté aux ganciclovir et à l’antibiotique ? (qui ont inséré le gène correctement par recombinaison homologue)
Dans le bouton embryonnaire
Comment appelle-t-on l’insertion d’un gène dans un génome ?
Transfection
Qu’est-ce que CRE ?
Enzyme (recombinase) qui excise l’ADN entre les locus loxP
Comment fait -on pour être capable d’avoir un embryon viable avec le système CRE/LOX ?
CRE = derrière un promotteur exprimé dans le tissus que l’on veut
Qu’est-ce qu’un Knockin ?
Ajout d’un codon stop entre 2 loxP, qui sera enlevé dans l’organe où CRE est exprimé (donne accès au gène)
Pourquoi faire un knockin ?
Pour éviter la surexpression (ou ajout dans un seul organe en particulier)
Comment intègre-t-on le système CRE/LOX ?
Par recombinaison homologue
Quel est le problème pour corriger un gène défectueux dans l’embryon ?
Insertion aléatoire
Est-ce que la thérapie germinale est acceptée sur l’humain ?
NON
Est-ce que la thérapie somatique est acceptée sur l’humain ?
OUI
Qu’est-ce que la thérapie génique germinale ?
insertion de cellule transgénique dans le bouton embryonnaire du blastocyste
Qu’est-ce que la thérapie génique somatique ?
Correction d’un phénotype par traitement de quelques cellules somatiques
Est-ce que toutes les cellules deviennent transgéniques dans la thérapie génique somatique ?
NON (ex: chimère)
Quelle est la technique pour la thérapie génique somatique ?
Prélever des cell d’un malade + rendre ces cell transgénique (introduction de copies du gène cloné de type sauvage) + cell réintroduites dans le corps du malade
Quels sont les deux moyens utilisés pour introduire le transgène dans les cellules ? (virus)
- Rétrovirus inactivé (défectif)
- Adénovirus
Quelles sont les avantages des adénovirus ?
- Ne s’intègre pas dans le chromosome (bon pour traitement chez l’humain)
- Attaque tous les types de cell (même celles qui ne prolifère pas - neurones)
Quelles sont les inconvénients des rétrovirus inactivé ?
- Insertion dans le génome des cell hôtes = effets mutagènes
- s’attaque seulement aux cellules en prolifération (pas neurones)
Qu’est-ce que Lentivirus ?
Mélange du rétro/adénovirus avec avantages des
Quels sont les avantages de Lentivirus ?
- S’insère dans le génome (pas de perte)
- peut attaqué les cellules qui ne prolifèrent pas
Nommez une autre méthode de thérapie génique - transporteur non-viral
Par les liposomes - autre méthode moins efficace avec ADN encapsidé à l’intérieur
Quel est la pathologie des enfants bulles ? Qu’est ce qu’elle fait ?
Syndrome de l’immunodéficience congénital (SCID)
*réussite de la thérapie génique pour la 1ere fois > altération du gène responsable
Fonctionnement anormal des lymphocytes B et T = infections répétés
Quelles cellules sont plus efficaces à traiter pour des maladies comme les enfants bulle ?
Utilisation de cellules de la moelle osseuse (cell souches)
Nommez un autre moyen d’introduire le transgène dans des cell
Chromosome artificiel humain (HAC) - transfecté à l’aide d’agents de transfection
*Observation par sondes fluo
Qu’est-ce que la thérapie génique anti-sens ?
Empêche la protéine d’être produite *Nouvelle technologie
Cible : ARNm (qui va devenir double brin -siARN- et dégrader) > rend le gène silencieux
La thérapie génique anti-sens est-elle post-transcriptionelle ?
OUI
Qu’est-ce qu’un dsRNA ?
ARN double-brin (qui rend un gène spécifique silencieux)
D’où viennent les siRNA?
du clivage de long dsRNA par l’enzyme DICER en fragments
*sont recrutés à un complexe ribonucléase (RISC) qui induit le clivage de l’ARNm ciblé
De quel ARN le complexe RISC est-il composé ?
siRNA
Que font les siRNA ?
Permet d’inhiber la traduction
+ pour contrôler les ARNm qu’on a introduit dans la cellule et lui permet de se diviser
Qu’Est-ce que les gRNA ?
Confère une résistance à la réinfection virale (effet mémoire)
Est-ce que l’édition du génome par Cas9 est précise ?6
OUI, enlève le gène de façon +++ précise
Qu’est-ce que la nucléase Cas9 clive ?
Les séquences homologue hybridé (double-brin) du gène > guide reconnu par Cas9
Que fait la thérapie génique anti-sens siRNA pour Fas ?
Fas = ligand de mort cellulaire
> Empêche de synthétiser la protéine FAS (Antisens sur l’ARNm qui produit FAS)
Est-ce qu’il est possible de détecter une mutation par analyse de type Southern en utilisant des sondes marquées ?
OUI (ex: modification des sites de restriction par mutations)
