Examen 2 Flashcards
On a un mélange de prot, comment faire pour identifier une seule des prots ?
Electrophorose couplé avec inmunobuvsrdaage
C quoi une electrophorèse de type SDS-PAGE et comment ca fonctionne? Dire les deux facteurs qui font varier la v de migration.
-Utilise sodium dodecyl sulfate (SDS)
- sur gel de polyacrilamide (PAGE)
SDS rend prots également négatives ET linéarité leur forme - migre selon seulement un facteur, leur poids mol
On peut donc faire varier vitesse migration par soit: viscosité ou voltage.
les grosses mol migrent moins vite à cause des mailles de polyacrylamide et les petites +++. En faisant varier la viscosité, ça affecte + les mol petites.
À quoi sert le tampon de chargement dans ou tampon de migration utilisé dans la préparation d’échantillon du SDS PAGE?
Contient du B mercaptoéthanol qui brise les ponts di sulfures des prots -> linéarise les prots
Pourquoi on utilise un gel de compression et un gel de résolution dans l’électrophorèse de type SDS PAGE
Gel de compression: pH 6,8 sert à mettre les prots à la même hauteur
Gel de résolution pH 8,8: sert à séparer les prots.
C quoi le rôle de APS et TEMED dans le SDS-PAGE
Agents oxydants qui catalysent la polymérisation du gel
- APS: ammonium persulfate
TEMED: met après et agit avec APS
Comment on fait passer les prots du gel à la membrane de nitrocellulose?
En se servant d’un courant électrique cathode -> anode so prot vont vers anode + car elles sont -
Une fois les prots transférées sur la membrane de nitrocellulose, on fait quoi?
- On met ronge de ponceau (colorant spécifique aux prots) pour voir si transfert à marché
- On retire le rouge avec tampon TBST
- On fait blocage avec TBST 5% lait (prots empêche nos anticorps de se fixer n’importe où sur membrane et d’aller juste sur leur prots spécifiques)
- Met membrane ERa dans sachet rempli d’anticorps primaire
- Met membrane Bactin dans sachet rempli d’anticorps de Bactin
Qu’est-ce que le Tamoxifene dans le traitement du cancer du sein hormonal dépendant.
C l’antagoniste du récepteur ERa, donc le traitement qui soigne le cancer (empêche croissance)
Lequel de MCF-7 et MDA-MB-231 ont le récepteur ERa? L’autre est cancéreuse pk ?
MCF-7: ERa
MDA: p53 mutée
Rendu à l’immunobuvardage de notre memvrane de Nitro, on fait quoi?
- Lave au TBST pour retirer les prots en excès qui sont pas fixées
(Juste pour membrane de ERa)
2. Incuber dans anticorps secondaire
3. Laver au TBST pour retirer prots non fixées
Pour les deux membrane
4. Laver au PBS1X
5. Ajouter réactif TMB
6. Couleur apparaît où y’a l’enzyme HRP (donc l’anticorps)
C quoi l’enzyme utilisée dans l’immunobuvardage et le réactif utilisé avec dans labo 6?
Enzyme: HRP horseradish peroxydase. En présence de H2O2 elle transforme TMB
réactif: TMB , tetramethylbenzidine se fait hydrolyser et devient bleuté.
Quantité de couleur proportionnelle à qt de prots
C quoi les cycles de PCR
Dénaturation 98oC
Hybridation 60-65oC
Amplification 72oC
Repeat
AVEC TAQ POL
Au labo 9 explique ce qu’on fait vite vite
On veut voir le génotype de nos souris pour déterminer lesquelles sont transgéniques.
On étudie le rôle de Akt et ses trois isoformes dans les cancers en faisant des KO dans des tissus spécifiques grâce a la CRE recombinase et ses sites LoxP.
On insère la gène de la CRE dans le gène du récepteur de progestérone.
DÉPISTAGE GÉNÉTIQUE
Pourquoi est-ce qu’on chauffe nos prots dans western Blot?
Pour assurer une dénaturation complète avec l’action du SDS et du B-mercaptoéthanol
Quel est l’avantage de la technique direct zol DNA/RNA miniprep kit
Tu as ton ADN et ARN dans une colonne et fais éluer les d’eux séparément en utilisant des tampons diff
C quoi et a queoi sert le TRIzol dans le labo 7?
Solution thiocynate de guanidium et phénol.
On s’ne sert pour solubiliser le culot.
- dénature prots (désactive RN/DNase)
- phenol extrait prots et acides nu
C quoi le chelex et a quoi ça sert dans labo 7? Pk on s’en sert juste sur les aliquotd de B?
-Solution qui se lie aux ions 2+ nécessaires aux nucléases (inhibent)
- purifie ADN et ARN
On s’en sert sur B parce que elles peuvent sécréter RNases et DNases
C quoi de l’eau DEPC
Eau traitée au diethylpyrocarbonate pour inhiber les RNases
On fait quoi avec le surnageant dans le labo 7?
Au début après avoir solubilisé les cellules et mis le trizol -> on le récupère (contient protsARN et ADN)
Quels éluats on garde dans le labo 7?
- ARN celui qu’on fait eluer aveccde l’eau
- ADN: celui qu’on fait eluer avec le tampon ADN elution
Comment fonctionne le NANodrop? Et permet de donner quelles données?
C un UV spectrophotomètre (mesure ABS de lumière UV)
- concentrations en ng/uL
- ratio de pureté vs prots et sels
L’ABS de ADN et ARN c 260nm
À quoi sert le EDTA dans le labo 8 pour faire migration
Molécule qui désactive enzymes dépendantes aux métaux (nucleases) en se liant au Fe et Ca2+
À quoi sert le TBE et c quoi dans la confection des gels d’agarose?
Tri borate EDTA buffer.
Utile pour la séparation de petits fragments. C un buffer pour le EDTA
Décrire P53 à quoi elle sert et quelle forme à la protéine et de que ça fait.
C un supredseur de tumeur qui bloque le cycle cellulaire à un point de contrôle pour s’assurer que l’ADN est bien correct.
C un tétramère, si un seul allèle mute ça devient dominant
XIAP
C un oncogene qui inhibe l’apoptose lorsqu’en grande C. Inhibe les caspases
Normalement elles sont éliminées ou inactivées si cellule passe en apoptose
Qu’est-ce qu’on fait au labo 8 en gros. Expliquer le principe
RT-qPCR.
On prend notre ARN extrait des cellules
- On met iScript DNase pour dégrader l’ADN restant qui contamine. On la désactive avec chaleur
- Met RT pour convertir ARN en ADNc
qPCR: on dilue ADNc 1/20
- On a des sondes TAQman pour tous types donc si couleur -> veut dire polymérisation.
PTEN
Suppressuer de tumeur .
C une phosphatase qui désactive les signaux de signalisation en amont de Akt. Si elle fonctionne pas ou t’en a pas assez -> Akt tjrs ou trop activée
Akt
Kinase proto oncogene. Active la voie de prolifération et est centrale à cette voie.
Existe sous 3 isoformes
Dans le labo 10 le plasmide qu’on insert aura quoi se plus des sis pour la selection des B?
GFP: fluorescence sous UV
Rampicilinne: tue toutes les B qui auront pas de plasmide, donc laissexjudte celle qui l’ont
Par quel processus les B sont infectes par le plasmide dans labo 10?
Par la transformation
C quoi E.coli DH5a ?
E.coli modifier pour faciliter l’entrée de plasmide.
À quoi sert le milieu SOC qu’on ajoutecaux aliquots de B dans labo 10?
Un Milieu boosté pour obtenir un taux de transformation maximal
Quels sont les résultats obtenis sur les 4 gelose du labo 10?
- Gelose normale B normals: tapis B
- G norm avec B transformées: tapis sans fluorescence car normale a prennebtcdessu
- Ampi B normals: rien qui poses
- Ampi trans: fluo, avec colonies satellites autour.
On fait quoi dans labo 11?
On fait sea tests genetiquea (PCR) vs tests diagnostic pour comparer l’identification. On sait juste que c des gram+
Decrire l’arbre decisionnel des gram+ et les tests
- Test catalase: met peroxide. Si bulles = + .
Si catalase + :
2. Coagulase: coagulase + = S.aureus
Si coagulase - :
- Test oxidase:, réactif de Wurster, si est oxydé-> couleur. (Oxy + = microcc)
Oxy - = staph non aureus
Si catalase -
4. Test hemolysis
Hemolysis a ou y= entero, S.pneumonia/viridans
Hemolysis B: strepcoccus
C quoi le streptest?
Sert a savoir ton strepto est groupe quoi en ajoutant un réactif voir si ca agglutine
C’est quoi la difference entre ELISA direct et indirect?
Direct: utilise un anticorps-enzyme spécifique a l’antigène. Permet de quantifier l’antigène
Indirect: utilise serum du patient pour quantifier sa réponse immunitaire en ahoutant après un anticorps secondaire pour quantifier avec couleur
On fait quoi dans le labo 11? But ?
Detecter la réponse immunitaire du patient en faisant un ELISA (test immunoenzymatique fluorescent) contre le VPH
But du labo 12 ?
-Faire une coloratioj HE pour voir les structures de nos coupes
- faire IHC pour detecter ou non presence de ERa dans quel tissu/portion de la cellule
À quoi sert le Permount dans le labo 12?
Maintient coloration.
Contient un antioxydant pour conserved long temps la lame
C quoi le DAB dans le labo 12?
Diaminobenzidine qui est oxydé par H2O2 en presence d’HRP-> couleur brunatre
A you sert le TBST5% goat serum
Agent bloquant pour pas que l’anticoprs se perde
Neoclear?
Substitut de xylene
Sert pour deparafinnage et clarification apres la dehydration
Comment fonctionne le marquage d’HE?
H: une base qui colore les composes acides en mauve (noyau, ribosome RE)
Eosine: un acide qui colore les basques en rose (cyplasme, paroi)
