Examen 2 Flashcards
Que significan las siglas de PCR?
Es la abreviación para “Polymerase chain reaction” en inglés, o reacción de cadena de la polimerasa, fue desarrollada por Kary Mullis en 1986
¿en que consiste la PCR y cuales son sus pasos?
Es una técnica de laboratorio utilizada para extender o coloquialmente hablando “hacer muchas copias” de una región en particular (región blanca) de ADN. Este proceso implica la síntesis enzimática de muchas copias de una región especifica usando Primer y dNTPs, la amplificación se realiza en etapas de ciclos sucesivos de elevación y disminución de temperaturas.
PASOS
1) Desnaturalización
2) alineamiento
3) extensión
Explique el proceso de los 3 pasos para la PCR
1) Desnaturalización: en este paso la temperatura sube con el propósito de romper los puentes de hidrogeno de las cadenas de ADN.
2) Alineamiento/Hibridación (40-60°C): una vez el tiempo de desnaturalización termina, la temperatura disminuye con el propósito de permitir a los primer reconocer y unirse a la región blanco. Es importante que en esta etapa la temperatura sea la correcta, ya que, si no es así, los primer se desnaturalizarían o formarían dimeros
3)Extensión(72°C): cuando el ciclo de alineamiento haya terminado, la temperatura debe subir nuevamente para activar al tag polimerasa e iniciar el proceso de inserción complementaria, a la cadena molde. de los dNTPs. Es aquí donde se generan los amplicones
Qué reactivos necesito para una PCR?
1) Muestra de ADN
2) Cloruro de magnesio
3) Primers o cebadores
4) Tag Polimerasa
5) dNTPs
6) PCR buffer
7) co.adtivantes de la reacción
Explica la función de cada reactivo para PCR
- Muestra de ADN contiene el fragmento target que deseamos amplificar
- Cloruro de magnesio cofactor esencia que activa a la tag polimerasa, dependiendo de la concentración puede inhibir a las nucleasas o amplificar cualquier sector
- Tag polimerasa enzima termoestable (extraída de la bacteria (Thermus aquaticus) que amplifica la región de interés, delimitada por los cebadores. La diferencia con el ADN polimerasa justamente es la capacidad de esta enzima de soportar altas temperaturas, característica de el ADN polimerasa no presenta.
- Primers o cebadores: oligonucleótidos específicos que se unen a secuencias especificas (son complementarios). Importante que el tamaño de estos cebadores no se extenso ni muy corto, ya que si es muy extenso costará la unión entre puntos de inicio, y si son uy cortos corremos el riesgo de que se unan a cualquier punto i segmento de la cadena o formar primer dimers
Normalmente se utilizan 2 cebadores
Forward
Reverse lee - dNTPsson los bloques de construcción de la nueva cadena que se forma y son incorporados durante la sinteis
- PCR Buffer para mantener un ambiente estable y evitar la desnaturalización de nuestras enzimas, nucleótidos etc, es necesario llevar a cabo el proceso en un buffer ,proporcionando no solo un pH optimo para el proceso sino que proporciona iones de magnesio necesarios para la actividad de la Taq polimerasa.
- Coadtuvantes de la reacción estos se utilizan cuando la muestra con la que trabajamos son complejas, quiere decir rica en citocinas y guaninas.
¿En base a que se define la temperatura de alineamiento?
La temperatura de alineamiento se define em base a los cebadores que se desean utilizar para amplificar la región blanco. La temperatura de melting es la temperatura a la cual se produce la disociación del enlacie de hidrogeno entre los cebadores y la secuencia complementaria de la molécula de ADN diana. Para saber específicamente que temperatura utilizar debemos tomar en cuenta la longitud de nuestros cebadores, y la composición de estos (procurando que tengan una baja concentración de citocina y guanina).
Una ves tengamos la longitud y concentración de C y G de nuestros cebadores, debemos comprobar que la diferencia entre el forward y el reverse sea menor a 5°C
Cómo elijo la secuencia Blanco o a amplificar?
1.Se debe realizar una búsqueda bibliográfica para poder identificar el segmento del gen de interés.
2.Seleccionamos el gen y lo conservamos
3.S e busca la secuencia elegida em NCBI
4.Seleccionamos la longitud de nuestro gen, esto depende del uso u objetivo
5.Seleccionamos una secuencia mas pequeña (del fragmento seleccionado en le paso anterior) a la cual denominaremos secuencia blanco
6.Debemos realizar otra búsqueda bibliográfica para identificar si mis regiones blanco coinciden con algún primer
EN GENERAL
Para elegir la secuencia blanco o la región de interés que se va a amplificar en una reacción de PCR, es importante tener en cuenta el objetivo de la amplificación y considerar la especificidad y sensibilidad de los cebadores. La secuencia blanco debe ser una región específica y única del ADN que se quiere amplificar y que no se encuentre presente en otras regiones del genoma o en otros organismos relacionados. Este proceso de selección puede implicar la realización de una búsqueda de secuencias homólogas en bases de datos públicas para asegurarse de que no existan otras secuencias similares o idénticas presentes en el genoma. También puede ser útil generar cebadores específicos utilizando software de diseño de primers que tenga en cuenta la especificidad y sensibilidad de la amplificación.
Para que sirve un BLAST? y una secuencia conceso
Basic Local Alignment Search Tool, es un algoritmo informático de alineamientos de secuencias génicas. Se utiliza principalmente para comparar secuencias de ADN o proteínas con base de datos buscar secuencias similares anteriormente registradas.
Mencione programas para diseñar primer y programas para hacer alineamientos.
Para diseñar primers usamos: Primer-Blast, In-SilicoPCR
Para hacer alineamientos : BLAST, T-Coffe (incluido en bio-edit)
- ¿De que depende la concentración de agarosa de un gel? como selecciono el voltaje de corrida? para que sirve el marcador de peso molecular?
La concentración del gel de agarosa depende del rango de tamaños de los fragmentos de ADN que queremos separar
El voltaje de corrida se selecciona en función de la longitud del gel y de la concentración de agarosa
El marcador de peso molecular se utiliza para determinar el tamaño de los fragmentos de ADN en el gel
- ¿De que depende la concentración de agarosa de un gel? como selecciono el voltaje de corrida? para que sirve el marcador de peso molecular?
La concentración del gel de agarosa depende del rango de tamaños de los fragmentos de ADN que queremos separar
El voltaje de corrida se selecciona en función de la longitud del gel y de la concentración de agarosa
El marcador de peso molecular se utiliza para determinar el tamaño de los fragmentos de ADN en el gel
Que carga tiene el ADN? por que? a que polo de la cuba electroforética migrará?
El ADN tiene una carga negativa, esto debido a la presencia del grpo fosfato en su estructura ,durante la electroforesis, en una cuba electroforética, el ADN migra hacia el polo positivo en un campo eléctrico, ya que se desplaza hacia la carga opuesta a la suya propia.
Que carga tiene el ADN? por que? a que polo de la cuba electroforética migrará?
El ADN tiene una carga negativa, esto debido a la presencia del grpo fosfato en su estructura ,durante la electroforesis, en una cuba electroforética, el ADN migra hacia el polo positivo en un campo eléctrico, ya que se desplaza hacia la carga opuesta a la suya propia.
Que es una secuencia conservada y que es una zona hipervariable.
Una secuencia conservada en genética es una secuencia de ADN que se mantiene relativamente constante en su estructura y secuencia entre diferentes especies o individuos, Por otro lado, una zona hipervariable es una región de ADN en la que puede haber muchas variaciones diferentes en la secuencia de ADN entre diferentes individuos o especies, debido a una menor importancia funcional o una selección natural menos restrictiva
A que no referimos como ADN recombinante?
Como su nombre indica, el ADN recombinante es aquel que presenta 2 genes de individuos diferentes ( el gen introducido y el del hospedante) Esta técnica de ingeniería genética permite la creación de moléculas de ADN artificiales que contienen características genéticas específicas de diferentes organismos o especies.
