Exam final Flashcards
Les protéines extraites via différents types de purification de protéines doivent elles toujours être pure?
par nécessairement, certaines purification vont seulement avoir comme objectif de concentrer un maximum la protéine
Que recherche-t-on comme principale qualité d’une purification d’enzyme?
une activité enzymatique. la pureté est secondaire et d’autres protéines vont souvent être ajouté pour stabiliser l’enzyme.
quels critères permettent de séparer des protéines l’unes des autres?
la taille La solubilité La charge La densité L'hydrophobicité des marqueurs ajoutés immunogénicité
Comment peut on séparer une protéine d’un mélange à l’aide de sa taille?
une filtration
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par sa solubilité
Précipitation aux sels
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par sa charge
Chromatographie d’échange d’ions
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par la densité
Sédimentation
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par son hydrophobicité
Chromatographie en phase inverse
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par des marqueurs ajoutés à celle-ci
chromatographie d’affinité
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par son immunogénicité
par immunoprécipitation
en quoi consiste des marqueurs ajoutés à des protéines, des tag.
quelles protéines peut on purifier gràce à ces tag?
une séquence d’Acide aminé particulière qui a une énorme affinité pour une résine ou un anticorps spécifique
Ces séquences peuvent être ajouté par génie génétique à des protéines à exprimer puis les protéines recombinantes peuvent être purifiées.
pourquoi ne pourrait on pas utiliser seulement les méthodes de purification protéiques les plus efficaces pour sortir une protéine d’un extrait cellulaire?
Certaines techniques coutent cher, ou sont simplement impossible à faire sur un extrait cellulaire crude à cause des composantes cellulaires comme les membranes/l’ADN
quelles critères recherche-t-on dans une méthode de purification de protéines?
sensibilité: capable d’isoler une protéine très diluée
Spécificité: ne ramasse pas la mauvaise protéine
réactifs disponibles
Coût faible
Court temps
à quelle longueur d’onde les protéines absorbent ils la lumière UV?
les aromatiques absorbent à 280nm
La liaison peptidique absorbe à 190-200nm
pourquoi n’utilise pas toujours la longueur d’onde du lien peptidique lorsqu’on cherche à suivre une protéine dans un protocole de purification?
les tampons utilisés dans des extractions absorbent aussi à des longueur d’ondes proche de 200nm.
C’est aussi une méthode très générale qui ne permet pas de suivre une protéine particulière.
quel acide aminée est massivement lié par le bleu de coomassie lors d’essais de colorimétrie protéique?
l’arginine. d’autre acides aminés sont liés de facon moins importante
Comment fonctionne la colorimétrie au bleu de coomassie?
Le colorant est jaune lorsqu’il est libre mais bleu quand il se lie à des acides aminés.
Lorsqu’on cherche à sourcer des protéines, y a t’il certaines limitations à la production in-vitro de n’importe quelle protéine?
Les protéines chez les eucaryotes plus complexes ont souvent des modifications post-traductionnelles. Si l’on cherche à faire exprimer ces protéines dans des procaryotes, les modifications PT vont être différentes.
Il y a aussi d’autres facteurs comme le repliement de la protéine qui peut poser des problèmes.
comment des inhibiteurs de polymérase peuvent ils être utilisé pour favoriser l’expression d’une protéine dans des procaryotes? (rifampicine comme exemple)
La rifampicine inhibe la polymérase endogène à E.coli
On peut modifier des bactéries pour qu’elles expriment des polymérases virales, qui ne reconaissent que les promoteurs viraux
On peut donc ajouter le gène de la protéine à exprimer sous promoteur viral.
En inhibant la polymérase endogène, il ne restera que la polymérase virale qui est spécifique au promoteur du gène de la protéine à exprimer.
pourquoi les extractions de protéines sont plus efficaces dans une chambre froide?
dans l’extrait cellulaire, il y a des protéases et des enzymes lysosomales qui fonctionnent à la température optimale pour la cellule
Le froid inhibe les réaction de ces enzymes
comment peut on inhiber l’activité des enzymes lysosomales et les protéases lors de purifications de protéines?
faire l’Extraction dans une chambre froide
Utiliser un tampon qui a un pH peu optimal pour l’enzyme
Les protéases peuvent aussi être inhibé par des molécules chimiques, des inhibiteurs de protéases)
pourquoi doit on ajouter des agents réducteurs à un mélande de purification de protéine?
l’atmosphère est beaucoup plus oxydant que l’intérieur d’une cellule, ce qui pourrait endommager les protéines
comment fonctionnent des homogénéisateurs Dounce et Potter. quelle est la différence entre ces deux homogénéisateurs et quelle est leur fonction?
ils servent à briser des cellules de facon mécanique pour éviter d’endommager d’autres composantes cellulaires comme les noyaux.
Ce sont des tubes où on dépose les cellules et où un insère un piston qui va briser les cellules. des pistons plus serrés avec la paroi du tube peuvent briser les noyaux alors que d’autres laissent les noyaux intact
Le piston dounce est un ‘‘UP and DOWN’’
Le piston Potter est attaché à un moteur rotatif.
comment fonctionne la presse aminco-French et à quoi sert-elle?
à lyser des cellules.
Elle est composé d’une potence qui va faire descendre un piston dans une chambre pressurisé.
Pour lyser les cellules, on indroduit les cellules à lyser dans la chambre pressurisée lorsque le piston est levé, on ferme la valve de sortie et on actionne le piston pour compresser le liquide
Cela fait augmenter la pression énormément dans la chambre. On ouvre ensuite la vis lorsque la pression est à son maximum pour relâcher un jet de lysat cellulaire.
quel est l’avantage d’utiliser une presse aminco-french plutot que d’autre méthodes de lyse plus simple?
elle permet de faire de grand volumes (50ml) et est très efficace
Comment fonctionne un homogénéisateur Bead Beater
on verse l’extrait dans une bouteille remplie de billes de verre. La bouteille est ensuite montée sur l’appareil qui consiste d’un rotor. en tournant, le rotor va envoyer les billes de verre dans toutes les directions et lyser l’extrait qui se trouve dans la bouteille.
comment fonctionne le sonicateur? et à quoi sert il?
il lyse des cellules en utilisant le phénomène de la cavitation.
En agitant les molécules d’eau, cela brise les ponts hydrogènes et permet de gazifier l’eau localement. L’eau gazeuse à 4C doit condenser sur les parois de la bulle, ce qui laisse du vide au centre de la bulle.
Pour combler le vide, l’eau rush au centre de la bulle et génère énormément d’énergie cinétique, ce qui brise les structures cellulaire.
qu’est ce que les corps d’inclusions?
des structures chez les bactéries où celles-ci regroupent des agrégats de protéines mal repliées. elles sont utilisées par les bactéries pour éliminer des protéines en exces.
Comment peut on récupérer des protéines dans un corps d’inclusion
on lyse les corps d’inclusion gràces à des méthodes mécaniques et on traite les protéines avec des agents chaotropiques qui vont permettre de briser les liens inter-protéiques et ainsi défaire les agrégats.
on peut ensuite dialyser cette suspension en ajoutant des agents qui favorisent le repliement correct des protéines.
En quoi consiste le fractionnement d’un lysat cellulaire?
une série de centrifugation à différentes vitesses pour séparer des composantes particulières dans des culots, comme les noyaux, les mitochondries et lysosomes ou des microsomes et ribosomes.
en quoi consiste la précipitation protéique au sulfate d’ammonium.
une protéine soluble doit être hydratée. En ajoutant des sels, l’eau va être séquestrée par le sel. en séquestrant assez de molécules d’eau, les protéines ne peuvent plus être hydratées et précipitent.
est ce que le % de saturation au sulfate de sodium est équivalent à son % en m/v?
non.
Comment peut on resolubiliser des protéines après une précipitation au sulfate d’ammonium
par la dialyse ou par filtration sur membrane
Comment fonctionne la dialyse
en placant un échantillon de protéine dans un sac à dialyse et mettre ce sac dans un bécher de tampon non-salé. la concentration de sel devrait s’équillibrer après un certain temps et ainsi retirer du sel dans le sac à dialyse où se trouvent les protéines.
comment fonctionne la filtration sur membrane avec centrifugeuse pour faire déscendre la concentration de sel.
l’échantillon est placé au dessus d’une membrane qui ne permet pas aux protéines de passer et qui est au dessus d’un tube collecteur
La centrifugation force le tampon salé au travers de la membrane dans un tube collecteur
On peut ensuite rajouté du tampon sans sel pour diluer encore plus la concentration de sel dans l’échantillon de protéine
pourquoi est il préférable d’utiliser un rotor à angle fixe plutot qu’un swinging bucket pour une filtration sur membrane?
l’angle du swinging bucket risque de faire sortir tout le liquide de l’échantillon et ainsi sécher complètement l’échantillon protéique, ce qui risque de faire coller les protéines sur la membrane.
qu’est ce qu’une sédimentation par centrifugation zonale
on centrifuge l’échantillon dans un gradient peu accentué. Les protéines s’enfoncent jusqu’à atteindre le fond.
en arrêtant la centrifugation, on peu séparer les protéines selon leur densité
quel est le désavantage de la centrifugation zonale par rapport à la centrifugation isopycnique?
Si on laisse la centrifugation zonale aller trop longtemps, toutes les protéines vont se retrouver au fond du tube.
en quoi consiste la sédimentation par centrifugation isopycnique
on centrifuge l’échantillon dans un gradient de densité qui couvre l’entièreté de la densité des composantes du mélange protéique.
ainsi, les protéines se sédimentent à leur propre densité et on pourrait faire centrifuger le mélange de manière indéfinis.
comment fonctionne une machine pour fabriquer des gradients de densité pour des centrifugations de sédimentation?
deux cylindres, un à une concentration élevé de sucrose et un à faible concentration. Les deux cylindres sont connectés par une petite fenêtre.
un deuxième trou permet de sortir du gradient en commencant par le sucrose à densité élevé. au fur et à mesure que les deux cylindres se mélangent, la densité descend.
Comment peut on faire un gradient pour sédimentation par centrifugation sans avoir recours à une machine pour fabriquer des gradients
en utilisant des mélanges de gradient autoformants comme le percol qui se séparent lorsque la centrifugation commence et créer le gradient qui va séparer les protéines
la sédimentation est une technique assez douce de séparation. En quoi cela est il important pour analyser des groupes de protéines
Les complexes protéiques peuvent facilement se séparer avec des techniques plus aggressives. Des méthodes douces comme la sédimentation permet d’isoler des complexes protéiques et d’analyser ceux-ci
quelle est la différence entre un gradient isopycnique contrinu et discontinu
un gradient continue est ‘‘comme son nom le dit’’, continue. il y a donc une concentration croissante lorsque qu’on déscend dans le tube.
Un gradient discontinu est constitué de coussins à concentrations définies.
où vont se retrouver des protéines dans une sédimentation isopycnique à gradient discontinu?
entre 2 coussins du gradient si leur densité se trouve entre celle des deux coussins (plus probable)
ou réparti dans un coussin si leur densité est identique à celle du coussin (moins probable)
en chromatographie sur colonne, comment sait-on que deux pics sont superposés?
un pic a une épaule définit d’un coté où de l’autre
à quoi ressemble une élution lente de protéines visqueuses dans un chromatogramme élué par colonne
un pic mou. (une grosse patate)
à quoi correspond une ligne verticale dans une chromatographie sur colonne?
une bulle d’air
à quoi correspond des séries de pics mou de forme sinusoidal dans une chromatographie sur colonne
un problème informatique avec le détecteur
quels détecteurs retrouve-t-on sur un appareil de chromatographie sur colonne?
à quoi servent-ils?
un conductimètre: à mesurer la quantité de sel dans la fraction récoltée
un moniteur UV: réglé à 280nm, il permet de doser la quantité de protéines tant que celles-ci possèdent des A.A. aromatiques.
comment fonctionne les résines pour chromatographie à échange d’ions
La résine est composé de polymères inertes auxquels ont greffe des composés qui possèdent une charge.
Cette résine lie les charges des protéines jusqu’à l’ajout de sels pour décrocher celles-ci
Est ce qu’une protéine à charge globale nulle peut être purifié par chromatographie à échange d’ions
Oui, si la protéine a une charge globalement nulle mais qu’elle possède des segments chargés, elle pourra se lier à la résine
quelles sont les charges des résines échanges de cations/anions
échangeuses de cation: charge négative
Échangeuses d’anion: charge positive
qu’est ce que travailler ‘‘en batch’’ pour faire une chromatographie sur colonne avec résines?
travailler en batch consiste à mettre la résine en poudre dans un large bécher puis on ajoute l’extrait à purifier.
toutes les manipulations vont être faites sur la résine dans le bécher plutot que sur la colonne pour éviter d’avoir à attendre que chaque goutte sorte de la colonne quand on travaille avec de larges volumes.
pourquoi est ce que tout les sels ne sont pas nécessairement idéaux pour déloger des protéines par chromatographie à échange d’ions?
Certains sels peuvent interférer avec l’activité de la protéine qu’on souhaite purifier.
Par exemple: le NaCl risque de rendre une ARNpol moins efficace après la chromatographie.
pourquoi doit on éviter d’utiliser un tampon qui a un pH identique au pI de la protéine à éluer?
Le pI est le point où les charges de la protéine s’annullent, il est donc plus difficile de lier des molécules d’eau et donc de rester solubles
Certaines protéines vont précipiter plus facilement à leur pI
Pour une chromatographie à échange de cations et d’ions, quel pH devrait on utiliser pour favoriser la séparation d’une protéine ayant un pI de 5.
échange de cations: pH plus faible pour favoriser l’ajout de protons sur les groupements basiques
Échange d’anion: pH plus haut pour favoriser les charges négatives
qu’Est ce qu’une résine d’hydroxylapatite?
une résine qui lie les charges positives ET négatives sur les protéines.
C’est une résine échangeuse de cations ET d’anions
qu’est ce qu’une colonne de filtration sur gel. Comment fonctionne la séparation sur cette colonne?
une colonne qui contient des billes de polymères poreuses. Les protéines trop grosses pour entrer dans les pores vont se créer un chemin entre les billes et sortir rapidement. Les protéines de taille moyenne vont avoir un chemin plus long et les petites protéines vont entrer dans les billes poreuses et prendre beaucoup de temps à être élué
donner l’ordre de taille des protéines qui sortent le plus rapidement au moins rapidement dans une colonne de filtration sur gel
Grosse en premier
moyenne en deuxième
petite en dernière
quelle forme de colonne est préférable pour:
- chromatographie de filtration sur gel
- chromatographie à échange d’ions
filtration sur gel: colonne longue et étroite
échange d’ion: court et large.
qu’est ce qui arrive si on dépose un échantillon de protéines extrèmement concentré en sel sur:
- une colonne échangeuse d’ions
- une colonne de filtration sur gel
- échangeuse d’ions: la protéine risque de passer directement au travers de la colonne
- colonne de filtration sur gel; rien, les protéines vont être élué de la même facon et risque même de réduire la concentration de sel dans l’échantillon
mise en context: on recueille la première fraction protéique qui sort d’une colonne de filtration sur gel.
En analysant cette fraction sur un gel SDS-page, on remarque plusieurs protéines de petite taille.
Que c’est il passé?
Les protéines étaient en complexe sur la colonne de filtration sur gel. les protéines ont été dénaturées lors du SDS-page et le complexe a été séparé en ses composantes de base.
qu’est ce qu’une chromatographie par intéractions hydrophobiques?
similaire à une chromatographie à échange d’ions mais se base sur une intéraction entre les résidus hydrophobes de la résine et les résidus hydrophobes de la protéine.
pour une chromatographie d’intéraction hydrophobiques, est il préférable d’avoir un échantillon très salé ou peu salé.
pourquoi?
très salé. les intéractions hydrophobiques sont stabilisées en absence d’eau. puisque cela permet à la protéine de favoriser l’exposition de ses résidus hydrophobes.
pour retirer l’eau d’une protéine, il faut augmenter le sel pour séquestrer les molécules d’eau.
au fur et à mesure qu’on avance dans une chromatographie d’intéraction hydrophobiques, est ce qu’on augmente ou diminue la concentration de sel
diminue
quelles type de protéine vont être élué en premier dans une chromatographie d’interaction hydrophobes, les hydrophiles ou hydrophobes. pourquoi?
Les hydrophiles, puisqu’elles n’ont pas beaucoup de résidus pouvant intéragir avec la résine et vont donc être rapidement décrocher quand ces intéractions sont délogées par la concentration de sel déscendante.
pourquoi les colonnes de HPLC permettent une pression plus élevée que les colonnes à résines utilisées pour des échange de cation, d’intéraction hydrophobes et de filtration sur gel
les colonnes de HPLC sont en métal plutot qu’en plastique/verre
que lien peut on faire entre le génie génétique et la chromatographie d’affinité?
si on fait exprimer la protéine dans un organisme modèle, on peut ajouter à la protéine un tag comme 6his ou flag tag qui permet de retirer la protéine à l’aide de ce tag.
que peut on utiliser pour faire éluer une protéine qui a un 6his-tag et qui se trouve sur une résine Ni-NTA
des concentrations croissantes d’imidazole
qu’est ce qui arrive si on met plus d’un tag sur une protéine cible?
rien. tant que les tag n’interfèrent pas avec la fonction de la protéine, on pourra utiliser les deux tag lors de la purification
à quoi sert le gel de concentration dans un SDS page, pourquoi est ce que le gel de concentration permet une meilleur séparation dans le gel de séparation
les protéines forment une large bande si l’on utilise pas de gel de concentration. Ces larges bandes ne permettraient pas une séparation évidente
En utilisant un gel de concentratino, les bandes deviennent très mince, ce qui permet de facilement séprer celles-ci
comment est ce que le gel de concentration permet de concentrer les protéines en utilisant des ions glycines et ions chlorures,
Lorsque l’électrophorèse commence, les ions Cl- filent immédiatement à la cathode, ce qui laisse seulement les ions glycines pour porter les protéines jusqu’au gel de séparation.
Cependant, les ions glycines ne sont presque pas chargés à pH 6,8 (le pH du gel de séparation)
Les protéines vont donc être ralenti par la migration lente des électrolytes dans le gel de concentration
pourquoi les protéines migrent elles selon leur poid dans un SDS-page alors que toutes les protéines ont un pI et donc une charge différente?
la préparation des protéiens pour un SDS page dénature celles-ci et appointe une charge négative en proportion à la taille de la protéine.
peu importe la charge intrinsèque de la protéine, elles vont avoir une charge négative proportionnelles à leur taille dans un SDS page
quels sont les avantages/désavantage de la révélation d’un SDS-page au nitrate d’Argent plutot que le bleu de coomassie
Le nitrate d’argent est beaucoup plus sensible mais ne peut pas être décoloré, contrairement au bleu de coomassie.
de plus, la coloration au nitrate d’argent n’est pas proportionnelle à la quantité de protéines sur la bande.
quel est l’effet de la glycosylation sur des bandes protéiques d’un SDS-page?
les bandes vont s’allonger
quel est l’effet de la phosphorylation d’une protéine sur un SDS-page?
La bande va être doublé. une bande pour la protéine phosphorylé et une popur la non-phosphorylée.
qu’est ce qu’un gel blue ntaive. quel avantage ce type de gel a t’il sur les SDS page?
un gel où on utilise le bleu de coomassie pour donner une charge négative aux protéines et permet de faire migrer celles-ci.
Ce type de migration n’utilise pas de détergeant et permet donc d’isoler des protéines en complexe
qu’est ce que l’électrofocalisation?
un gel où on retrouve un gradient de pH. Les protéines dans ce gel vont migrer jusqu’au pH de leur pI. Lorsque les protéines atteigne leur pI, leur charges sont comblées et elles arrêtent de migrer dans le gel.
qu’est ce qu’un gel 2D?
un gel de séparation de protéines où on sépare premièrement les protéines selon leur pI par électrofocalisation
On sépare ensuite les protéines ayant le même pI selon leur taille par SDS-page.
qu’est ce qu’un western blot (immunobuvardage)
c’est une coloration de protéine suite à la migration de celles-ci. au lieu d’être fait sur gelm les protéines vont être transférés sur une membrane et coloré par des anticorps.
comment peut on vérifier si des pics obtenus par spectrométrie de masse correspond au pic où la protéine a une charge de 1 (z=1)
en faisant le plus petit commun multiple des pics obtenus.
Comment sait-on que des pics obtenus par spectrométrie de masse ne sont pas équivalent au pic de Z=1
le deuxième pic n’a pas un ratio m/Z 2 fois plus petit que le premier pic.
quelle digestion enzymatique est faites à des protéines qui vont être séquencées par MS/MS, qu’est ce que cela nous apporte comme information?
une digestion tryptique.
Cela assure que le dernier acide aminé est une lysine.
quel caractéristique interessante du dichroisme circulaire nous permet de faire des analyses avec enzymes et substrat?
le dichroisme circulaire peut se faire sur une enzyme qui accomplie son travail
qu’est ce qui est mesuré par le dichroisme circulaire
la résultante de deux onde lumineuse déphasées qui peut tourner de pas droit ou de pas gauche.
comment interprète-t-on les valeurs obtenues par du dichroisme circulaire
L’absorbance des hélices alpha cause un décalage de la résultante des deux ondes qui peut être mesuré
Le spectre de cette résultante selon la longueur d’onde est spécifique à certaines strucures comme des hélices alpha, des feuillet beta ou des formes désorganisées.
à quoi correspond la mesure de PPM dans un spectre RMN
à la distance de l’atome analysé par rapport à un étalon interne.
qu’est ce qui est mesuré lors d’une analyse RMN
Les atomes d’hydrogène sont irradiés avec certaines longueurs d’onde, ce qui les excitent et ceux ci vont relâcher cette énergie de menière détectable
en quoi la longueur d’onde est elle importante lors de la RMN?
Les atomes d’hydrogènes ne vont pas changer de Spin à la même longueur d’onde selon les atomes qui composent leur voisinage.
qu’est ce qu’on peut déduire d’un pic de RMN qui est 3 fois plus haut qu’un autre pic?
il y a 3 fois plus d’hydrogènes dans le même voisinage que le deuxième.
qu’est ce qui dédouble dans un spectre RMN?
comment peut on prédire combien de pics vont se retrouver à un hydrogène particulier?
le nombre d’hydrogènes voisin à un hydrogène particulier va influencer le nombre de dédoublement du pic.
Le nombre de pic correspond au nombre d’hydrogènes voisin+1
pourquoi les pics RMN peuvent ils être dédoublés par leur voisin
un hydrogène de faible énergie va faciliter la transition vers une position de haute énergie chez son voisin.
à l’inverse, un hydrogène de haute énergie va empêcher son voisin d’atteindre une haute énergie, le voisin va donc avoir besoin de plus d’énergie pour flipper.
En résultat, un hydrogène ayant un hydrogène voisin va avoir 2 pics à cause de l’état de son voisin
Le même s’applique pour un hydrogène à plusieurs voisins. Si un hydrogène possède 2 voisins, il va y avoir 3 pics, un pour des voisins fort-frot, un pour faible-faible et un pic plus élevé pour fort-faible
qu’est ce que la RMN en 2D, ou correlation spectroscopy
on excite chaque hydrogène progressivement en passent chaque longueur d’onde une après l’autre
en excitant un hydrogène à la fois, on va pouvoir voir le signal de ses voisins à cause du transfère d’énergie vers le voisin.
