Exam final Flashcards
Les protéines extraites via différents types de purification de protéines doivent elles toujours être pure?
par nécessairement, certaines purification vont seulement avoir comme objectif de concentrer un maximum la protéine
Que recherche-t-on comme principale qualité d’une purification d’enzyme?
une activité enzymatique. la pureté est secondaire et d’autres protéines vont souvent être ajouté pour stabiliser l’enzyme.
quels critères permettent de séparer des protéines l’unes des autres?
la taille La solubilité La charge La densité L'hydrophobicité des marqueurs ajoutés immunogénicité
Comment peut on séparer une protéine d’un mélange à l’aide de sa taille?
une filtration
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par sa solubilité
Précipitation aux sels
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par sa charge
Chromatographie d’échange d’ions
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par la densité
Sédimentation
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par son hydrophobicité
Chromatographie en phase inverse
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par des marqueurs ajoutés à celle-ci
chromatographie d’affinité
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par son immunogénicité
par immunoprécipitation
en quoi consiste des marqueurs ajoutés à des protéines, des tag.
quelles protéines peut on purifier gràce à ces tag?
une séquence d’Acide aminé particulière qui a une énorme affinité pour une résine ou un anticorps spécifique
Ces séquences peuvent être ajouté par génie génétique à des protéines à exprimer puis les protéines recombinantes peuvent être purifiées.
pourquoi ne pourrait on pas utiliser seulement les méthodes de purification protéiques les plus efficaces pour sortir une protéine d’un extrait cellulaire?
Certaines techniques coutent cher, ou sont simplement impossible à faire sur un extrait cellulaire crude à cause des composantes cellulaires comme les membranes/l’ADN
quelles critères recherche-t-on dans une méthode de purification de protéines?
sensibilité: capable d’isoler une protéine très diluée
Spécificité: ne ramasse pas la mauvaise protéine
réactifs disponibles
Coût faible
Court temps
à quelle longueur d’onde les protéines absorbent ils la lumière UV?
les aromatiques absorbent à 280nm
La liaison peptidique absorbe à 190-200nm
pourquoi n’utilise pas toujours la longueur d’onde du lien peptidique lorsqu’on cherche à suivre une protéine dans un protocole de purification?
les tampons utilisés dans des extractions absorbent aussi à des longueur d’ondes proche de 200nm.
C’est aussi une méthode très générale qui ne permet pas de suivre une protéine particulière.
quel acide aminée est massivement lié par le bleu de coomassie lors d’essais de colorimétrie protéique?
l’arginine. d’autre acides aminés sont liés de facon moins importante
Comment fonctionne la colorimétrie au bleu de coomassie?
Le colorant est jaune lorsqu’il est libre mais bleu quand il se lie à des acides aminés.
Lorsqu’on cherche à sourcer des protéines, y a t’il certaines limitations à la production in-vitro de n’importe quelle protéine?
Les protéines chez les eucaryotes plus complexes ont souvent des modifications post-traductionnelles. Si l’on cherche à faire exprimer ces protéines dans des procaryotes, les modifications PT vont être différentes.
Il y a aussi d’autres facteurs comme le repliement de la protéine qui peut poser des problèmes.
comment des inhibiteurs de polymérase peuvent ils être utilisé pour favoriser l’expression d’une protéine dans des procaryotes? (rifampicine comme exemple)
La rifampicine inhibe la polymérase endogène à E.coli
On peut modifier des bactéries pour qu’elles expriment des polymérases virales, qui ne reconaissent que les promoteurs viraux
On peut donc ajouter le gène de la protéine à exprimer sous promoteur viral.
En inhibant la polymérase endogène, il ne restera que la polymérase virale qui est spécifique au promoteur du gène de la protéine à exprimer.
pourquoi les extractions de protéines sont plus efficaces dans une chambre froide?
dans l’extrait cellulaire, il y a des protéases et des enzymes lysosomales qui fonctionnent à la température optimale pour la cellule
Le froid inhibe les réaction de ces enzymes
comment peut on inhiber l’activité des enzymes lysosomales et les protéases lors de purifications de protéines?
faire l’Extraction dans une chambre froide
Utiliser un tampon qui a un pH peu optimal pour l’enzyme
Les protéases peuvent aussi être inhibé par des molécules chimiques, des inhibiteurs de protéases)
pourquoi doit on ajouter des agents réducteurs à un mélande de purification de protéine?
l’atmosphère est beaucoup plus oxydant que l’intérieur d’une cellule, ce qui pourrait endommager les protéines
comment fonctionnent des homogénéisateurs Dounce et Potter. quelle est la différence entre ces deux homogénéisateurs et quelle est leur fonction?
ils servent à briser des cellules de facon mécanique pour éviter d’endommager d’autres composantes cellulaires comme les noyaux.
Ce sont des tubes où on dépose les cellules et où un insère un piston qui va briser les cellules. des pistons plus serrés avec la paroi du tube peuvent briser les noyaux alors que d’autres laissent les noyaux intact
Le piston dounce est un ‘‘UP and DOWN’’
Le piston Potter est attaché à un moteur rotatif.
comment fonctionne la presse aminco-French et à quoi sert-elle?
à lyser des cellules.
Elle est composé d’une potence qui va faire descendre un piston dans une chambre pressurisé.
Pour lyser les cellules, on indroduit les cellules à lyser dans la chambre pressurisée lorsque le piston est levé, on ferme la valve de sortie et on actionne le piston pour compresser le liquide
Cela fait augmenter la pression énormément dans la chambre. On ouvre ensuite la vis lorsque la pression est à son maximum pour relâcher un jet de lysat cellulaire.
quel est l’avantage d’utiliser une presse aminco-french plutot que d’autre méthodes de lyse plus simple?
elle permet de faire de grand volumes (50ml) et est très efficace
Comment fonctionne un homogénéisateur Bead Beater
on verse l’extrait dans une bouteille remplie de billes de verre. La bouteille est ensuite montée sur l’appareil qui consiste d’un rotor. en tournant, le rotor va envoyer les billes de verre dans toutes les directions et lyser l’extrait qui se trouve dans la bouteille.
comment fonctionne le sonicateur? et à quoi sert il?
il lyse des cellules en utilisant le phénomène de la cavitation.
En agitant les molécules d’eau, cela brise les ponts hydrogènes et permet de gazifier l’eau localement. L’eau gazeuse à 4C doit condenser sur les parois de la bulle, ce qui laisse du vide au centre de la bulle.
Pour combler le vide, l’eau rush au centre de la bulle et génère énormément d’énergie cinétique, ce qui brise les structures cellulaire.
qu’est ce que les corps d’inclusions?
des structures chez les bactéries où celles-ci regroupent des agrégats de protéines mal repliées. elles sont utilisées par les bactéries pour éliminer des protéines en exces.
Comment peut on récupérer des protéines dans un corps d’inclusion
on lyse les corps d’inclusion gràces à des méthodes mécaniques et on traite les protéines avec des agents chaotropiques qui vont permettre de briser les liens inter-protéiques et ainsi défaire les agrégats.
on peut ensuite dialyser cette suspension en ajoutant des agents qui favorisent le repliement correct des protéines.
En quoi consiste le fractionnement d’un lysat cellulaire?
une série de centrifugation à différentes vitesses pour séparer des composantes particulières dans des culots, comme les noyaux, les mitochondries et lysosomes ou des microsomes et ribosomes.
en quoi consiste la précipitation protéique au sulfate d’ammonium.
une protéine soluble doit être hydratée. En ajoutant des sels, l’eau va être séquestrée par le sel. en séquestrant assez de molécules d’eau, les protéines ne peuvent plus être hydratées et précipitent.
est ce que le % de saturation au sulfate de sodium est équivalent à son % en m/v?
non.
Comment peut on resolubiliser des protéines après une précipitation au sulfate d’ammonium
par la dialyse ou par filtration sur membrane
Comment fonctionne la dialyse
en placant un échantillon de protéine dans un sac à dialyse et mettre ce sac dans un bécher de tampon non-salé. la concentration de sel devrait s’équillibrer après un certain temps et ainsi retirer du sel dans le sac à dialyse où se trouvent les protéines.
comment fonctionne la filtration sur membrane avec centrifugeuse pour faire déscendre la concentration de sel.
l’échantillon est placé au dessus d’une membrane qui ne permet pas aux protéines de passer et qui est au dessus d’un tube collecteur
La centrifugation force le tampon salé au travers de la membrane dans un tube collecteur
On peut ensuite rajouté du tampon sans sel pour diluer encore plus la concentration de sel dans l’échantillon de protéine
pourquoi est il préférable d’utiliser un rotor à angle fixe plutot qu’un swinging bucket pour une filtration sur membrane?
l’angle du swinging bucket risque de faire sortir tout le liquide de l’échantillon et ainsi sécher complètement l’échantillon protéique, ce qui risque de faire coller les protéines sur la membrane.
qu’est ce qu’une sédimentation par centrifugation zonale
on centrifuge l’échantillon dans un gradient peu accentué. Les protéines s’enfoncent jusqu’à atteindre le fond.
en arrêtant la centrifugation, on peu séparer les protéines selon leur densité
