Exam Final Flashcards
Expliquer le déroulement du labo chapitre 2 de préparation d’ADN plasmidique
- Culture de DH5a Fiq pBS/GFP et pUC19
- Isoler l’ADN plasmide par 3 solutions diff (RNase/lyse/précipitation de composants CellR)
- C’est le surnageant qu’on met dans colonne (plasmides)
- Silice de colonne lie ADN plasmide
- Éluer ADN avec alcool
- Dosage Spector ADN
Décrire le contenu des 3 solutions de miniprep plasmidique du chapitre 2 et décrire les réactifs leur rôle
S1: solution de resuspension de cellules et RNase (pour pas qu’ARN cachent l’ADN)
S2: solution lyse alcaline
-SDS: dodecylsulfate de sodium solubilise la paroi CellR
-NaOH: dénature ADN Xsome et aide lyse
S3: solution neutralisation
-acétate ammonium: précipite prots et ADN Xsome grande taille
- guanidine: facilite liaison ADN plasmidique à silice
Expliquer le labo chapitre 3 dans ce qu’on fait
Digérer avec ENZr PstI et SalI qui ont des sites uniques sur Pbs/GFP et sur pUC19 pour éventuellement insérer GFP dans pUC19
On digère le vecteur donneur et receveur avec les deux mêmes ENZr pour INSÉRER GFP UN SENS
lié à promoteur LacZ
Dire dans chapitre 3 quel ADN va migrer le plus vite sur le gel entre GFP digéré et digéré partiellement
On s’attend à voir quoi sur le gel?
Digere est linéaire donc va migrer moins vite même si poids réel le même que partiellement/pas digéré qui va être superenroulé.
On s’attend à voir GFP à environ 770pb même si son gène contient moins car la coupure a pris un peu de pBs
Quels sont les 3 résultats possibles de fragments après digestion de pBS/GFP et les 2 résultats après digestion de pUC19 dans chapitre 3
- GFP
- pBS sans GFP
- pbs incomplète donc à GFP mais linéaire
- pUC19 digeré
- Partiellement dig
Expliquer c’est quoi la propriété étoilé d’un ENZr?
Activité enz perturber par présence de glycérol fait qu’au delà de 3h de PCR elle perdent leur spécificité
C’est quoi le SYBRsafe et ocmmmet on s’en sert
Molécule fluorescente qui se lie à l’ADN sans changer sa conformation
On s’en sert de marqueur d’ADN dans gel Agarose
À quoi sert le glycérol dans nos tampons de chargement?
Augmenter densité de ADN pour que solution tombe au fond puits chargement
Au labo chapitre 4, on veut extraire du gel quels fragments d’ADN et leur poids?
GFP digéré à 770pB
Et pUC19 linéaire qui sera le vecteur receveur à 2,7kB
But et méthode et étapes grandes lignes chapitre 4
Extraire les fragments ADN GFP et pUc-9 linéaires de Agarose en faisant fondre morceaux découpés
Après on extrait de Agarose par affinité de ADN avec silice en présence de C++ sels pH neutre.
On lave ADN avec éthanol
Pour libérer et extraire on lave solution faible C sels pH 7,5
On dose spectro et on migre Agarose pour voir pureté et présence
Quel est le problème dans extraction de labo 4 de ADN de Agarose
Dosage montre un grande contamination en sels/organique
Cause: éthanol utilisé pour laver ADN y’en reste. Fallait attendre qu’il s’évapore et on sentait avec le nez pour gager = sketch
but méthode étapes du labo chapitre 5
ligation des ADN purifiés et digérés GFP et pUC19 par T4 ADN ligase en présence d’ATP et Mg2+
+ TRansformation de DH5a F Iq avec produit de ligation
quand on calcule qt insert à utiliser dans le mèlange de ligation on doit X par ratio molaire d’insert/vectuer de cb?
3 (3/1)
le ratio molaire de ligation 1:3 est utilisé juste pour les vecteurs de … pB. Sinon, on fait quoi?
plus petit qeu 800pB
plus grand que 800pB = 1:6 ou si bouts francs ou si pas déphosphoryké
L’enzyme T4 ADn ligase provient de quel organisme? Doit être en présence de quelles molécules pour bien fcontionenr et le Mg2+ sert à quoi?
- Bacteriophage
- ATP et Mg2+
- Favoriser extension des groupements P de ATP
Quels sont les resulatts sur gelose après la transformation des B avec le produit de ligation GFP/pUC19
- Pas de croissance = transfo pas réussie
- Colonies bleues= insert mais pas ligation à bonne place car produit du B-gal
- Colonies blanche fluo
- Colonies un peu fluo (produit naturellement leur GFP ou style )
À quoi sert le tween 20 dans labo 7 pour le transfert de port?
Se retrouve dans le TBST1X pour laver les ports de la membrane. C’est une nettoyant aqueux.
but méthode étapes du labo chapitre 5
vérifie la capacité d’induction de nos B après leur ligation. GFP induit par IPTG qui bloque le répresseur LacI
- prend B transformées et non transformées et on fait précultures dans bouillon (+C de B)
- on prépare 6 tubes (CN-NI,CNind, CPni, CPind, ET-In et ET-NI) et on met IPTG dans ceux induits.
- incuber pour laisser induire
- met tampon de lyse/chargement pour détruire B et incuber
Expliquer c quoi le SDS et PAGE dans SDS-PAGE
SDS: dénaturant prots + confère charge - homogène aux prots
PAGE: gel polyacrylamide
À quoi servent le TEMED, persulfate d’ammonium, glycine , dans le SDS-PAGE
TEMED: catalyse polymérisation gel
Persulfate: catalyseur et avec TEMED accélère poly du gel
Glycine: anion qui transporte courant E (dans tampon migration)
Diff entre gel de compression et gel de résolution dans SDS-PAGE
Compression: pH léger acide (6,8) et peu acrylamdie (5%) pour que prots soient même hauteur
Résolution: fort %12,5 acrylamdie pour bien diff prots par poids et pH 8,8 pour permette charge négative
Quelle est poids mol de GAPDH et GFP
GFP: 27kdA
GAPDH: 37
Décrire le principe d’isolation purification ARN par précipitation
Utilise TRIZOL qui contient phénol et isothiocyanate de guanidie (agent dénaturant de prots pour défaire celles liées aux ARN)
Permet de lyser cellules mais surtout inhiber fortmement RNases donc pas de dégradation.
On ajoute chloroforme pour séparer ARN (+purete ARN)
Trois phases après centri:
Phase aqueuse (ARN), interphase d’ADN et phase organique (prots, ADN et phénol/chloroforme)
Récolte phase aqueuse et ajout d’isopropanol pour précipiter ARN
LAVER ARN par éthanol
Décrire la technique d’extraction/purification ARN par colonne
ARN de meilleure qualité parce qu’on extrait ça exprès et car on ajoute DNase 1.
Même principe avec trizol, sauf qu’après on sépare les phases avec diff solutions de lavage.
Résultat plus pur mais on peut obtenir juste ARN.
Pourquoi on prend primer ôligo dt dans RT?
Pour se lier aux ARN queue poly À donc on analyse ARN matures
Dans le labo 10 on faisait quoi et expliquer la méthode
on faisait une RT de nos ARN matures. Rend en ADNc
Étapes: hybridation amorcés
Synthèse brin ADN (37oC/1h)
Inactivation enzyme (65oC)
Incubation à froid
Il faut dNTPs, RTranscriptase, primers, l’ARN
Expliquer la méthode du labo 11
PCR de nos ADNc de GFP/GAPDH
- Dénaturation 94oC ADNdb en ADNsb
- Hybridation à 50-70oC amorces sens et anti sens s’hybordent
- Elongation 72oC Taq polymerase
- Repete les cycles
Avantages de marqueur massruler express (2)
Longueur plasmide (pB)
Et masse en ng
Rôle méthanol dans tampon de transfert ?
Maximise absorption des prots sur nitrocellulose
