exam théo 1 Flashcards
C’est quoi des nucléases? Font quoi comme activité? viennent d’ou et leur rôle initial.
-enzymes qui digèrent liens phosphodiesters selon une séquence spécifique reconnue
- B,
- rôle de protection contre virus
Les sites de reconnaissance des ENZr sont longs comment?. Quel type de séquence c’est?
- 4 à 16 nu
- palindrome : séquence identique de 5’ à 3’ sur les deux brins complémentaires
Quels sont les 3 types de clivage d’ENZr? comprendre ça donne quoi
- bouts francs: coupe en plein milieu de séquence. dépasse pas
2.1 bouts collants extrémité 5’ : coupe deux places diff, dépasse par extremité 5’
2.2 bouts collants extrémité 3’ : …
Lors de sous-clonage, pourquoi on a avantage à utiliser des ENZr brins collants? (2)
- localisation pour former molécule recombinante va se faire plus facilement, moins énergie. Meilleur rendement.
- maximise spécificité de ligation
ligases d’ADN font quoi?, sur quels types de clivage on peut faire ? Ligase la plus utilisée?
- rcatalysent réparation liens entre phosphate et hydroxyle (5’ et 3’ )
- sur bouts francs et collants mais collants si nu les deux brins sont complémentaires
3, ligase t4 venant phages
EcoRI: quel type clivage, vient quelle B, reconnsiy quelle séquence, on peut-tu relier avec ligase?
- bouts collants 5’
- E.coli, première ENZr
- GAATTC
- oui
Quelle est la charge d’un G phosphate quand: sol alcaline? sol neutre:
alca: - (normalement dans cell)
neutre : neutre
Expliquer le fct d’une ADN phosphatase et dans le concept d’un sous-clonage. Quand est-ce qu’on fait cette étape?
- enlève G phosphate du 5’
- empêche vecteur accepteur de se refermer et d’être religué par ligase
- on fait étape avant insérer insert si on a utilisé juste UNE ENZr
Comment on fait pour ajouter insert si on a utilisé une ADN phosphatase. Comment ça marche
- L’insert lui a des G phosphates, donc liaison par ligase sur juste un seul brin à chaque site de coupure (2/4)
- recircularisation par possbile
- réparation complète et liaison complète une fois insert dans cellule hôte.
que signigie le terme sous-clonage
Former une nouvelle constru moléculaire en mettant un insert d’un vecteur qui le contenait déjà à un autre qui est vide mais mieux adapté.
C quoi un ADN recombinant. C quoi un plasmide chimère
Dès que ADN étranger ajouté dans ADN.
On amplifie dans B pour X ADN qu’on a
chimère: Plasmide recombinant
C quoi le clonage
ensemble des étapes nécessaires à la prod d’un molécule d’ADN recombinant.
quelles sont les 2 utilités principales du clonage moléculaire
- analyser role fragment ADN/gène
- biotech: produire en grande quantité une prot recombinante (insuline)
décrire les plasmides: comment se répliquent, leru forme, taille, mêmes gènes que ADN Xome? combien de copies? rôles
- répliquent aux-mêmes avec ORI
- circulaire 2x brin
- k- 10k pB
- non, gènes diff
- plusieurs copies par B
- prolif, R, survit milieux diff
Quelles sont les composantes d’un vecteur de clonage (3)
- ORI: réplication autonome du plasmide
- Marquer de sélection (gène R antibio)
3.SCM: séquence ADN 100 nu ajouter articfiellment au vecteur où on met l’insert
Diff entre sélection et criblage. SCM FAIT PARTIE DE QYOI?
Sélection: place B dans milieu sélectif (voit celles qui on intègre plasmide)
Criblage: on Check après quelles B expriment une construction plasmidique (par LacZ/Xgal dans le SCM)
La B galactosidase est formée de? Décrire comment on s’en sert pour crublsge sélection bleu blanc
2 sous unités: LACz oméga ( dans ADN chromo) et lacZ alpha (qu’on ajoute avec insert)
Active expression par IPTG. On met subrast (x-gal). Faut bleu si présence de B-galacto=
Bleu = pas d’insert dans plasmide
Pour le criblage, quelle info il manque à savoir après la sélection bleu-blanc? Comment on fait?
Si l’insert est dans le bon sens
On met gène de GFP dans insert,
Si bon sens= production de GFP et donc visible
Quelles sont les 2 composantes du criblage vleu-blanc
Génomique: LacZ Omega
Plasmidique; LacZ alpha
Les B E.coli ont été trafiqués pour retiré le leur gène LacZ alpha chromosomique pour pas qu’elles produisent B-galactof
à quoi sert le tampon de chargement et fait de quoi
fait de glycérol et colorants.
Mélange à échantillon pour le rendre dense et visible. Diminue diffusion dans reste du gel.
Le voltage et la durée de migration sont déterminés en fct de ? (2)
- taille/conformation
- concentration agarose
agarose est, sert à?
un polymère de sucre
faire des gels pour analyser ADN (purifier/séparer, déterminer taille de fragments ou ADN)
la migration d’ADN sur gel dépend donc de ? (2)
taille et conformation
quelles sont les 3 formes possibles d’ADN plasmidiques? qui qui migre le plus vitee
- circulaire superenroulé: forme naturelle, migre le plus vite
- circulaire relâché: cassure d,Un des brins. moins compact= le plus lent
- ADN linéaire: lorsque ADN coupé deux brins au même endroit (enzymes). Le deuxième plus vite
PLus les fragments à séparer sont longs et lâches, plus il faut une… C d’agarose. le contraire esrt vrua pour de petits fragments compacts.
petite C pour gros
Grande concentration pour petitus
À quoi sert le tampon de migration (2), il contient quoi?
- contient ions pour permettre passer courant
- permet pH basique pour PO4- ADN soit négatif et que çâ migre vers pole +
Contiennent du EDTA et du TBE (tris-borate)
à quoi sert EDTA dans tampon migr et le TBE?
EDTA: agent chélateur, inhibe activité DNases
TBE: tampon, conserve pH base et conditions ioniques pour courant
Comment on fait pour visualiser l’ADN migré après? (2)
- SYBRsafe: lie à ADN :fluo si UV
- EtBr: agent intercalant: fluo si UV
PK on utilise E.coli pour études?
Peu chère
facilement modifiable
font pas de méthylation ADN
reprod rapide
culture facile
peu pathogènes
Quelles sont les 2 caractéristiques importantes de E.coli DH5a LacIq?
- ADN chromosomique a pas LacZ alpha
- LacI ( répresseur de LacZ) est toujours induit = LacIq. Permet de contrôler par IPTG quand produit B-gala
IPTG agit dur quoi et comment?
se lie au répresseur LacIq et l’empehce de se lier de bloquer le promoteur.
Décrire une stratégie de digestion ENZr pour déterminer quelles B ont insert dnas le bon sens (si t’As pas mis GFP mettons)
- choisir 2 sites de restriction qui sont pas utilisés déjà
- ils doivent couper une seule fois dan insert et l’Autre une fois dans vecteur
3, doit pas couper en plein milieu de insert - tu calcules la distance nete les deux coupures, les fragments après migration devrairnt avoir la longueur attendue, et pas l”Autre qui correspond ç mauvais sens.
