Exam 2 Flashcards
1
Q
est-ce qu’un adaptateur peut former des polymeres comme les linkers ?
A
non
2
Q
Quel ADN ligases est utilisé pour la construction d’une molecule recombinante et quel est son cofacteur ?
A
Phage du T4 E.coli ayant pour cofacteur l’ATP
3
Q
Quelles sont les fonctions naturelles de la ligase T4?
A
- répare les coupures simple-brin («nicks») dans une molécule d’ADN double-brin (substrat physiologique) et
- ligature des molécules d’ADN possédant des bouts collants.
4
Q
Quels lients cree le phage T4?
A
des liens phosphodiester entre le groupe 5’P et 3’OH
5
Q
Quelles sont les strategies de clonages ?
A
1-Clonage conventionnel avec vecteur coupé avec enzyme de restriction ou dT/tailled, l’ADN ligase du phage T4 est utilisé
2- clonage de produits PCR dans un vecteur TOPO
3-Clonage basé sur la methode de gibson
4- clonage basé sur la complementarité de queues d’homopolymeres
6
Q
Quels sont les points a considerer pour la ligature dans la strategie de clonage conventionnel?
A
1) ≠ conditions pour la ligature de fragments avec bouts collants et francs
2) influence de la concentration et de la longueur des fragments sur le type de produits formé dans les reactions de ligature de fragments avec bouts collants
3) methode pour prevenir la circulation du vecteur avec la phosphatase alcaline
4)strategies de ligature de fragments avec bouts francs(liniers, adaptateurs)
7
Q
quels sont les deux type de fragment d’ADN utilise par la ligase T4?
A
Fragments bouts francs et fragments bouts collants
8
Q
Quelle ligature est la plus efficace entre celle des bouts francs et celled des bouts collants ?
A
La ligature des bouts collants
9
Q
Quels agents contenus dans les melange de liagture de NEB favorisent l’appariiemment des bouts collants ?
A
le Polyéthylène glycol 8000 ou le chlorure s’hexamminecobalt
10
Q
Quel est le mecanisme réactionnel de l’ADN ligase du phage T4?
A
1) similaire a la ligase qui lie le NAD+ chez E.coli au lieu de l’ATP
2)le groupe adenylate de l’ATP se lie a une lysine présente dans le site actif de l’enzyme puis il est transféré sur le groupement 5’P de l’ADN
3) Un attaque nucleophile sur le 3’OH
11
Q
Qu’est-ce qui favorise la reaction de la liagse du phage T4?
A
La forte activité de la phosphodiesterase
12
Q
A combien de type de produits mene la reaction de ligature?
A
2 types du produits (vecteur recirculariser et molecule recombinante) dont une seule pourra se repliquer
13
Q
Existe-t-il des conditions de ligature favorisant la formation de molécules recombinantes ?
A
OUI, l’expression graphique de l’equation de Dugaiczyk permet de predire quels types de produits seront formes durant la ligature d’ADN a differentes concentration
14
Q
D’apres le graphique de Dugaiczuk un i/j <2 correspond a quoi?
A
Concatenaire linéaires
15
Q
D’apres le graphique de Dugaiczuk un i/j >2 correspond a quoi?
A
Monomeres circulaires
16
Q
Quelles sont les conditions recommandees pour ligaturer un insert avec un vecteur plasmidique ?
A
-[ADN] < 10ug/ml
-Rapport molaire insert:vecteur de 2:1 ou 3:1
17
Q
Dans des conditions optimales d’une reaction de ligature avec des fragments a bouts collants compatibles, quel est le produits majoritaire ?
A
le vecteur recircularisé (70%)
18
Q
Comment rendre compatible les bouts du vecteur et les bouts de fragments generer avec le remplissage partiels des bouts 5’ ?
A
Il faut ajouter 2nt avec le fragment de klenow
19
Q
Trois approches permettent de maximiser la formation de molécules recombinantes, lesquelles ?
A
- Déphosphorylation du vecteur: coupure avec une seule enzyme de restriction et dephosphorylation à l’aide de la phosphatase alcaline
- Clonage directionnel: coupure avec 2 enzyme de restrictions pour generer des bouts incompatibles
- Remplissage partiel des bouts 5’ protuberantes incompatibles: coupure avec une enzyme pour generer bout 5’ avec depassement de 4 nt qui sont incompatibles avec les bouts diu vecteur.
20
Q
Que fait la phosphatase alcaline ?
A
elle catalyse l’hydrolyse des residus 5’P de fragments d’ADN ou ARN portants des extremites franches ou collantes
21
Q
Quel est l’avantage de la methode de remplissage partiel 5’ par rapport aux deux autres ?
A
elle genere des fragments qui ne peuvent se lier entre eux meme donc ca previent l’insertion de plus d’un fragment
22
Q
Quels sont les desaventages de la ligature de fragments à l’extremités franches?
A
1) Ce type de ligature est inefficace
2)Les sites de restriction aux jonctions du vecteur et de l’insertion peuvent etre éliminés
3)Les molecules recombinantes peuvent contenir plusieurs copies de l’insertion en tandem
23
Q
Quel est la ≠ au niveau de l’utilisation entre les linkers ou des adaptateurs ?
A
Les ‘linkers’ sont toujours ajoutés à des insertions portant des bouts francs, alors que les adaptateurs peuvent aussi être ajoutés à des insertions portant des bouts collants pour les rendre compatibles avec les extrémités du vecteur
24
Q
Definition d’un linkers?
A
oligonucléotide de 8-12 bases de longueur (8-12 mers), qui s’associe avec lui-même pour donner de l’ADN double-brin avec bouts francs. Il contient un ou plusieurs sites de restriction.
25
Definition d'un adaptateur ?
il est préparé à partir de deux oligonucléotides dont les séquences sont en partie complémentaires et contiennent, chacune à une des extrémités la séquence de reconnaissance pour une enzyme de restriction distincte.
26
Que faut-il faire aux linkers avant de les utiliser et comment ?
Doivent etre phosphorylés a leur extremites 5' avec la polynucleotide kinase du phage T4 en presence d'ATP
27
Quand est-ce que l’utilisation des « linkers » devient problématique? Quelle sont les deux solutions ?
devient problématique lorsque les sites présents dans ces molécules se retrouvent aussi dans les fragments à cloner
Peut etre regler par:
1. Traiter les fragments avec méthylase de l'enzyme de restriction utilisée
2. Utiliser un adaptateu(mieux)
28
Qu'est-ce qui empeche les adaptateurs de se polymeriser entre eux ?
ils ont des extremites OH dont une seule sera phosphorylee (celle qui va être clonée)
29
Quels sont les d’avantages que les adaptateurs offrent plus que « linkers »?
1. La polymérisation de l'adaptateur est évitée en ne phosphorylant qu'une seule des extrémités 5' (l’extrémité que l'on veut lier à l'ADN cloné)
2. Un fragment généré par une enzyme donnée peut être cloné dans un vecteur digéré par une enzyme différente qui génère des extrémités incompatibles (diapos 27 et 28)
3. Des sites de restriction internes peuvent être ajoutés pour faciliter l'excision de l'insertion
4. L’utilisation des adaptateurs n’est pas limitée au clonage; ils servent pour le séquençage en masse (diapos 29-36)
30
Que permet de faire la ligature de fragments(avec un adaptateur) ayant bouts imcopatibles ?
1-allongement possible de la sequence
2- on peut ajouter des sites de resitrictions
31
Decrire l'utilisation des adaptateurs dans le sequencage en masse?
1) les fragments genomiques sont joints a des adaptateurs pour les amplifier par PCR
2)les fragments PCR obtenu sont briser mecaniquement puis un A est ajouté a leur 3' par la Taq
3)lier les fragments obtenus avec un adaptateur ayant la forme Y forme de 2 oligo de 60nt dont les sequences sont en partie complementaires
32
Quelle est la liaison non covalente la plus forte ?
biotine-streptodivine
33
a quoi sert le groupement phosphate en 5' de l'adaptateur en Y?
il sert a stabiliser et proteger le T complementaire au A ajouter par la TAQ apres bris mecanique des fragments
34
A quoi sert l'index de 6nt dans l'adaptateur en Y?
permet d'identifier specifiquement les echantillons lors du sequencage en masse
35
Mecanisme du Clonage basé sur la complémentarité de queues d’homopolymères?
On utilise la désoxynucléotidyle transférase terminale pour ajouter une queue d'homopolymère aux extrémités 3' d'une insertion munie de bouts francs, et pour ajouter également les nucléotides complémentaires aux extrémités d'un vecteur linéarisé (Fig. 3.6). Ces queues d'homopolymères peuvent s'apparier pour former un cercle. Les brèches sont réparées par les enzymes de la cellule-hôte comme klenow durant la transformation.
36
Stratégies de clonage non conventionnelles : clonage dans un vecteur TOPO?
* Les trousses de clonage basées sur la topoisomérase I du virus de la vaccine incluent un vecteur linéarisé (au site de clonage) portant une molécule de topoisomérase I à chacune de ses extrémités 3’ phosphate (diapo 41)
* Quand le vecteur TOPO est mélangé avec le fragment d’ADN à cloner (avec extrémités 5-OH), l’enzyme crée des liens covalents entre extrémités 3’ phosphate et 5’ OH, réunissant ainsi l’insertion au vecteur
* Puisque la topoisomérase I est déjà attachée au vecteur, la réaction ne requiert que l’interaction de deux molécules et est donc beaucoup plus rapide et efficace qu’une réaction de ligature conventionnelle qui nécessite l’interaction de trois molécules
* Contrairement à l’ADN ligase, le fragment d’ADN ligaturé par la topoisomérase ne doit pas avoir de groupement 5’ phosphate. Ce système de ligature est donc applicable au clonage de fragments PCR qui ne sont pas normalement phosphorylés à leurs extrémités 5’
37
Tous les vecteurs de clonage possèdent les éléments suivants:
1. Réplicon
2. Marqueur(s) pour sélectionner le vecteur
3. Sites(s) de clonage
4. Marqueur pour sélectionner les molécules recombinantes
38
Que contient une banque d'ADNc?
collection de clones recombinants contenant tous les elements de sequence du genome
39
Vrai ou faux: les banques d'ADNc ne ontiennent que les sequences condantes des genes exprimés donc sans introns?
vrai
40
Pourquoi on prefere faire des banque d'ADNc des eucaryotes plutot que des procaryote ?
epissage alternatif et abondance des introns(ADN égoïste)
41
quel est la formule pour calculer. le nombres de clones a analyser ? et quelles sont les donnees ?
N=ln(1-P)/ln(1-a/b)
N =nombre de clones requis
P=la probabilité désirée
a=taille moyenne des fragments inseres dans le vecteur
b=taille du génome
42
La marche chromosomique est utilisee a quelles fins?
1-Pour cloner des genes lies a des marqueurs polymorphiques
2-Obtenir la sequence complete d'un gene pour lequel on possede qu'un clone de la sequence partiell ou d'ADNc
43
Qu'est-ce qui pourrait interrompre la marche chromosomique ?
La repetition de sequence dans le fragment utilise comme sonde
44
Quels vecteurs très utiles pour isoler de très longs segments de chromosome?
Les vecteurs PAC, BAC et YAC
45
le premier vecteur de clonage d’utilisation générale est ?
pBR322
46
Les séquences de pBR322 proviennent de combien de plasmides naturels de quelle bacterie?
3 plasmides naturels(R1,R6-5 et pMB1) de E.coli
47
Comment se réplique de manière pBR322?
pBR322 se réplique de manière unidirectionnelle à partir de l’extrémité 3’ d’une amorce d’ARN (RNAII)
48
Pourquoi il faut utiliser un marqueur de sélection pour identifier les transformants?
Car la transformation de cellules compétentes est une méthode inefficace car on obtient que 0,01 de cellules competantes avec 1ng d'ADN
49
Comment agissent les agents de selections ?
il inhibent la synthese proteique en se liant au ribosome
50
Quels sont les agents de sélections pour le plasmide pBR322?
Ampicilline et/ou tétracycline
51
Comment sélectionne-t-on les plasmides pUC recombinants?
En une seule étape. Après transformation d'une souche d'E. coli contenant la partie manquante du gène lacZ, les cellules sont étalées sur une boîte d'agar contenant de l'ampicilline, de l'IPTG (isopropyl-B-D-thiogalactoside) et du Xgal (5-bromo-4- chloro-3-indolyl-β-D-galactoside). L'IPTG inactive le répresseur et, par conséquent, induit la synthèse du fragment α. Le Xgal est un substrat chromogène pour la β-galactosidase; lorsqu'il est hydrolysé par cette enzyme, il devient bleu. Les colonies contenant le plasmide sans insertion (les cellules synthétisant la β-galactosidase) sont bleues, alors que les colonies recombinantes (pour la plupart incapables de synthétiser la β-galactosidase) sont généralement blanches.
52
A quoi sert le gene ccdB?
Il produit une proteine poison qui s'attaque a l'ADN gyrase ce qui empeche la replication
53
A quoi sert les lysozymes+EDTA dans la purification d'ADN plasmidique ?
Degrader les batteries
54
A quoi sert les lle sucrose 25% dans la purification d'ADN plasmidique ?
garder la solution isotonique
55
A quoi sert le triton x-100 dans la purification d'ADN plasmidique ?
Dissoudre la membrane cellulaire
56
Lors de l'enrichissement par difference de longueur ou se trouve les plasmides apres centrifugation ? et l'ADN?
-plasmide dans le surnageant
- ADN culot
57
Comment recolte-t-on de l'ADN dans la purification par concentration des gradients de CsCl? ou se trouve les proteines et l'ARN?
le gradient est de plus en plus eleve vers le bas du tube. L'ADN se concentre autour de 1.70g/cm3
L'ARN FORME UN CULOT EN BAS ET les proteines sont tout en haut
58
Quelles sont les deux conformation de l'ADN plasmidique circulaire ?
super-enroulé et circulaire avec une cassure nick
59
Le EtBr s'intercalle plus dans l'ADN linéaire ou super-enroule?
ADN lineaire
60
Comment utilise-t-on le complexe EtBr-CsCl pour purifier l'ADN?
On fait un gradient de densite de CsCl saturé avec EtBr. On detecte l'ADN super-enroulé qu'on retire a l'aide d'une seringue. On agite cet extrait dans du butanol pour retirer le EtBr. Ensuite on retire le CsCl par dialyse
61
Quelle methode est utilisé par les trousses commerciales de purification d'ADN plasmidique ?
Chromatographie sur bille de silice en presence de thiocyanate de guanidium avec une augmentation progressive de sel
62
A quoi sert l'incubation en presence de chloramphenicol?
amplification des copies de plasmides de E.coli sans que la cellule ne se replique
63
Comment fonctionne le cycle lytique du bacteriophage Lambda?
Le phage injecte son materiel genetique qui se replique et s'assemble puis lyse la cellule. Des nouveaux phages sont alors relâchés
64
Comment fonctionne le cycle lysogenique du bacteriophage Lambda?
L'ADN du phage s'integre dans celui de la cellule hote. Celui-ci va donc être repliqué ce qui va mener a un cycle lytique
65
Comment sont cultivés les phages ?
On melange de l'agar+phage+bacterie qu'on étale
66
Dans quel site est-ce que l'ADN concatemerique formé durant la réplication de λ par cercle tournant est clivé?
Il est clivé au site cos lors de l'étape d'encapsidation
67
Quelle longueur d’ADN peut-on placer dans des têtes de phages par encapsidation in vitro dans le but d’obtenir des particules infectieuses?
La taille d'ADN doit etre comprise entre 38-52 kpb
68
Comment les vecteurs λ d’insertion ont été fabriqués?
Les vecteurs λ d’insertion ont été fabriqués par élimination des régions non-essentielles de λ sauvage
69
Que permettent Les vecteurs λ de remplacement comparer a celui d'insertion ?
Les vecteurs λ de remplacement permettent de cloner de plus grands fragments d’ADN
70
Quelle est la tratégie générale de clonage dans un vecteur λ de remplacement?
Clivage du vecteur avec des enzymes de restrictions. Retrait du fragment non essentiel puis ligation avec le fragment d'ADN
71
Comment minimiser la formation de phages parentaux dans des expériences de clonage avec les vecteurs d’insertion?
1. Déphosphorylation du vecteur. Les extrémités collantes du vecteur (sites cos) sont d'abord associées, le vecteur est digéré avec l'enzyme ou les enzymes de restriction appropriées, et finalement les extrémités 5’ sont déphosphorylées
2. Digestion du vecteur avec deux endonucléases de restriction produisant des bouts incompatibles. Cette approche permet le clonage directionnel de l'ADNc
72
comment minimiser la formation de phages parentaux dans des expériences de clonage avec les vecteurs de remplacement?
Pour minimiser la réinsertion du fragment remplaçable (fragment ‘stuffer’), on a recours à l'une des trois méthodes suivantes :
1. Séparation du fragment ‘stuffer’ des bras du vecteur par centrifugation dans un gradient de sucrose ou par électrophorèse sur gel d'agarose
2. Digestion du vecteur avec deux endonucléases de restriction afin de générer des bouts non complémentaires entre le ‘stuffer’ et les bras. Par exemple, on digère EMBL4 avec BamHI et EcoRI et on précipite les grands fragments obtenus avec de l'isopropanol. Dans ces conditions, les oligonucléotides compris entre ces deux sites de restriction ne précipitent pas
3. Remplissage partiel d’extrémités 5’ protubérantes
73
Quelles sont les 4 methodes de sélection des phages recombinants?
1. Inactivation insertionnelle du gène cI de λ (sélection hfl-) (claire=recombinant et opaque= non-recombinant)
2. Inactivation insertionnelle du gène lacZ ou lacZ' (colonie bleues ou blanches de B-galactosidase)
3. Sélection du phénotype Spi (seul le recombinant peut infecter la cellule
4. Sélection par la taille
74
Quand est-ce que les insertions de λZAP peuvent être isolées sous la forme de plasmides?
lorsque les cellules contenant les phages λZAP recombinants sont surinfectées avec un phage M13 auxiliaire
75
La purification d’ADN de λ est effectuée à partir de cultures liquides d’E. coli infectées par des bactériophages. Pour il faut contrôler la densité de la culture bacterienne ?
Car il faut une lyse complète tout en ayant une grande quantité finale de phage
76
Comment sont séparés les bactériophages des bactéries non lysées et des débris cellulaires?
1)par centrifugation. On retrouve les phage dans le surnageant car ils sont trop petits
2)On precipite le surnageant de bacteriophage dans du polyethylene glycol avec du NaCl
3) purification par centrifigutation dans un gradiient de CsCl avec du SDS pour briser les liaaison et Ethanol pour purifier
77
C'est quoi un cosmide?
un hybride bactériophage-plasmide qui a des sites cos. Les cosmides sont des plasmides de 5-7 kpb pouvant être encapsidés in vitro pour former des particules de phages. Ces vecteurs permettent le clonage de fragments de 38-52 kpb.
78
Que permet un site cos?
Faire de la transfection
79
A quelle etape du cycle du phage sont selectionnes les cosmides ?
a l'etape d'encapsidation
80
Le clonage dans les cosmides implique les étapes suivantes:
1. Le cosmide est linéarisé avec une enzyme de restriction appropriée.
2. L'ADN d'intérêt (AND donneur) est partiellement digéré avec une enzyme
générant des bouts compatibles à ceux du cosmide.
3. Ligature du vecteur avec les fragments donneurs de manière à produire des
molécules concatémériques(linéaires).
4. Encapsidation in vitro.
5. Infection d'E. coli
6. Sélection des transformants sur un milieu contenant un antibiotique.
81
jusqu'a combien de pb peut-on inserer dans le phage de M13?
4000 pb
82
Quelle est la diffference entre le phage lambda et le M13 niveau infection ?
lambda tue completement la cible alors que M13 rend juste malade
83
Comment la présence d’une origine de réplication f1, fd ou M13 dans un phagemide permet la production de pseudo- particules de phage contenant de l’ADN simple-brin?
On integre une proteine de replication dans un plasmide incapable de se repliquer. Celle ci va pouvoir se repliquer par cercle tournant et produit de l'ADN simple brin
84
C'est quoi des pseudos particules de phages ?
Des particules de phages qui ne contiennent pas les genes du M13
85
Le vecteur YAC permet de faire le clonages de ?
tres grands fragments d'ADN chez la levure jusqu'a 500 kpb
86
Quelle est l'idee deriere la methode avec le YAC?
L'idée est de produire une molécule recombinante qui sera comme un chromosome chez la levure
87
Quels sont les inconvénients que présentent certains gènes d’E. coli K12 pour le clonage?
1) l'ADN recombionant dégradé introduit dans cette souche sera degradés par EcoK1
2)etant methylé a certains sites dam et dcm, il ne pourra etre coupé par certaines enzymes de restriction
3)L'ADN d'eucaryotes superieurs contenants des ilots CpG ne pourront etre cloné sous forme de long fragments car il sera degradé par le systemne de restrictions modif mcr mrr
88
Quelle sont les inconvénients de RecA pour le clomnage ?
1)Son activité peut causer des deletins lorsqu'il ya recombinaison
2)Son activité peut causer des rearrangement lorsqu'il y'a des sequences repetées ou inversees
89
Quelle est la souche E.coli K12 ideale pour le clonage?
dam- mcrBC- recA- hsdRMS- mar- dcm-
90
C'est quoi une banque d'ADN?
C'est une collection de clones recombinants
91
Qu'est-ce qu'une banque d'ADN génomique par definition?
Clones recombinants dont l'ensemble represente tout le materiel genetique de l'organisme.
92
Qu'est-ce qu'une bande d'ADN complémentaire par definition?
Clones d'ADN recombinants dont l'ensemble represente la population d'ARNm d'un tissu donné de l'organisme étudié. Ils refletent l'abondance des ARNm dans le tissus
93
VRAI OU FAUX: les banques d'ADNc contiennent toutes les sequences du genome ?
faux ils ne contiennent que les sequences codantes et les regions 3'-5' UTR des ARNm
94
VRAI OU FAUX: les banques d'ADNg contiennent toutes les sequences du genome ?
Vrai ils contiennent toutes les sequences meme les non codantes
95
de quoi depend le nombre de clones requis pour construire une banque d'ADNg?
de la complexité du genome et du vecteur de clonage utilisé
96
Quel est l'objectif de l'equation de Clark et Carbon?
Le but est d'estimer le nombre de clone a analyser pour trouver une sequence donneé dans une banque d'ADNg
97
Quelles sont les deux hypotheses sur lesquelles repose l'equation e Clark et Carbon?
1) l'ADNg a ete clivé de maniere completement aleatoire lors du clonage
2)Chaque molecule hybride pouvait donner lieu a un clone et ce avec la meme efficacité
98
Pourquoi la methode de fragmentation de l'ADNg est importante dans la qualité de la banque?
Car il faut produire des fragments qui se recoupent et qui sont d'une longueur appropriée pour le vecteur de clonage
99
Quelles sont les differentes etapes d'un protocole de digestion partielle d'ADNg?
1) determiner les conditions de digestion sur une echelle analytique : digerer une quantite constante d'ADN avec des quantite varable d'enzyme ou incuber l'ADN avec des quantité constantes d'enzymes pendant des periodes variables et suivre par electrophorese
2)Digestion partielle d'une grande quantité d'ADn en utilisant les conditions déterminées a l'etape précédente
3)fractionner les fragments de longueurs désirée par electrophorese sur gel d'agarose ou centrifugation sur gradient de sucres
100
C'est quoi une marche chromosomique?
Elle sert a cloner des genes liés a des marqueurs polymorphiques et a obtenir la sequence complete d'un gene pour lequel on ne possede qu'un clone de sequence partielle ou clone d'ADNc
101
Quelle est la relation entre la longueur des pas effectué lors de la marche chromosomique et la longueur des fragments inseré?
Ils sonht proportionnels
102
Quels sont les vecteurs qui peuvent etre utilisés pour la construction d'une banque d'ADNg?
PAC,YAC,BAC,cosmide, lambda de remplacement
103
Dans quel cas est-ce que l'utilisation d'un cosmide est préférée pour construire une banque d'ADN?
Lorsque le gene ne peut etre contenu dans un seule phage lambda
104
Dans quel cas est-ce que l'utilisation d'un les vecteur PAC YAC et BAC sont préférée pour construire une banque d'ADN?
Pour isolement de tres longs fragments de chromosomes
105
décrire la construction d'une banque d'ADNg dans Lambda
le bacteriophage lambda est coupé pour garder deux fragments cos tandis que l'ADNg aussi est clivé plusieurs fois. L'ensemble est liguer avec la T4 ligase et empaqueter in vitro dans le bacteriophage
106
Quels sont les vecteurs les plus utilises pour la banque d'ADNc
Les veceturs lambda d'insertion
107
Comment se fait la construction d'une bande d'expression dans λgt?
L'ARN message a un poly A a son 3'. On ajoute une queue de polyT avec un site de restriction et cela va s'apparier et polymeriser le premier brin. On ajoute un poly G au 3' du brin formé et la terminal transferase va ajouter des C. Le reste de la polymerisation se fera avec le fragment de klenow ou la transcriptase reverse.
108
Pourquoi les proteines de fusion ne sont pas produites de maniere constitutivess a partir des vecteurs λ d'expression? et comment se regle se probleme ?
car plusieurs de ces protreines sont toxiques et peuvent empecher la formation de plage de lyse. Il faut donc les etaler sur une souche portant le represseur lac prevenant la synthese de ces proteines
109
Quelles sont les 4 etape de sequencage d'ADN par la methode de Sanger?
1-reaction de sequence
2-electrophorese des produits de reaction sur gel de sequence
3-detection des fragments
4-lecture de la sequence
110
a quoi sert l'incorporation du ddNTP dans une chaine d'ADN?
Bloquer la croissance de cette dernière
111
Comment distinguer les bases aux extremités des chaines avec le ddNTP?
Chaque ddNTP doit etre couple avec un colorant fluorescent a une longueur d'onde qui lui est propre
112
Quelles sont les caractéristiques des gels de sequence ?
-peuvent separer des fragments differents de seulement 1base
-peuvent separer jusqu'a 500bases
-contiennent de l'urée
113
les appareils modernes de sequencage utilisent plutot l'electrophorese dans........ pour separer les chaines d'ADN. Ces...... permettent une lecture d'environ..... base
des tubes capillaire
1000 base
114
comment appelle t-on le format graphique des donnees generees par les sequeceur ?
electrochromatogramme
115
Quelle ADN pol est utilisee pour le sequencage ?
la version modifiee de l'ampliTaq
116
Pourquoi l'ampliTaq est modifiee pour les sequencage ?
Car elle produit un bruit de fond avec son exouclease 5'-3'
117
Laquelle des enzyme CS ou FS permet de lire le plus de base et nécessite moins d'enzyme pour la reaction ?
FS
118
Que permet la thermostabilité de CS et FS?
Cela permet de de sequencer meme des regions ayant de fortes structures secondaires, d'utiliser des conditions plus strictes d'hybridation d'amorce et sequencer par la methode cycle sequencing
119
Quelles sont les deux types d'amorce de sequencage et leur caracteristiques ?
amorce universelle(paire) et amorce specifique a l'insertion pour les sequences tres longues
18-29 mere et 40-50%GC
120
quelles sont les gabarit d'ADN utilises pour le sequencage d'ADN?
- ADN simple brin provenant dun vecteur M13 ou Phagemides
-ADN double brin denaturé provenant de plasmides,cosmides,clone λ et produit PCR
121
Quelles sont les etapes de sequencage d'ADN double brin par la methode cycle sequencing?
1-denaturation de la matrice a 90
2-appariement de l'amorce a 50
3-eleongation avec un ddNTP et 4 dNTPs a 60
122
Quelles sont les deux approches permettant de sequencer des longs fragments d'ADN ?
1- approche aleatoire
2-approche systematique
123
laquelle des deux strategies de sequencage de long fragments neccessite une carte physique ?
l'approche systématique
124
Qu'est-ce qui presente une limite pour la methode aleatoire de sequencage
le genome eucaryotique possede beaucoup de sequence repetees donc risque d'assembler les deux sequence
125
Quelle approche permet de regler le probleme des sequence repettees dans le sequencage ?
Clone contig approach
126
a quoi consiste la methode clone contig approach?
Clonage d'une serie de longs fragments provenant de BAC qui se chevauchent
127
Quelles les 3 strategies possible avec l'approche systemique de sequencage de long fragments d'ADN?
1) Sequencer des sous-fragmennts dont les positions relatives sont connues donc avec une carte physique
2-utiliser une serie d'amorce specifiques au fragment a sequencer
3- sequencage d'une serie de sous-fragments obtenus par deletions sequentielles du fragment d'interet avec des exonuclease
