exam 1 Flashcards
Quelles sont les limites de la PCR qui font qu’on doit encore utiliser le clonage?
1) les sequences de chaque cote diu gene doivent etre connues
2) La longueur de l’ADN qui peut etre amplifier est limitee
Quel est le role de l’EDTA dans la preparation de l’extrait cellulaire?
Affaiblir la paroi celllaire et inhiber l’activité des enzymes cellulaire qui degradent L’ADN
L’EDTA est quel type de produit ?
Un agent chelateur
Quels types d’ions lient l’EDTA?
les ions divalent comme Mg++ pour faire fonctionner la polymerase ou la DNAse
Qu’est le SDS?
un agent denaturant les proteines
Quel est le role du SDS dans la preparation de l’extrait cellulaire ?
Il permet de dissocier les proteines membraniares et d’inhiber l’activité des enzymes cellulaire
Quelles sont les deux approches pour la purification de l’extrait cellulaire ?
1) degrader jes contaminant avec le phénol
2) degrader les contaminant avec une chromatographie sur colonne echangeuse d’ion ou par la methode du thiocyanate de guanidinium et silice
Comment la purification par le phenol se fait ?
Le phenol permettra de completement homogeneiser la solution et ainsi apres centrifugation on recupere les different constituant:
- en haut ADN+ARN
- au milieu des proteines coagulées
- en bas le phenol
Comment se fait la purification par chromatographie echangeuse d’ion ?
en trois etapes:
l’ADN, l’ARN et certaines proteines sont chargees negativement alors elles se lient a la resine positive. Pour les detacher il faut:
1)fixer l’extrait cellulaire dans une colonne
2) laver avec du sel pour faire eluer les proteine et l’ARN
3) laver avec une plus grande concentration de sel et recuperer l’ADN
Comment se fait la purification par la méthode de thiocyanate de guanidium et silice?
En presence de ce composé, l’ADN se lie fortement a la particule de silice et par la suite pouvant etre libere en ajoutant de l’eau
Quel est la fonction du thiocyanate de guanidium et silice ?
Agent denaturant(chaotropique) les proteines et solubilisant la solution
Quels sont les avantages de la purification et Comment se fait la purification par la methode de thiocyanate de guanidium et silice?
A la fin nous obtenons un ADN sans sel et cette methode peut etre automatisee avec des aimants permettant ainsi de traiter de nombreu echantillons a la fois
Quels sont les deux methode de prelevement de l’ADN ?
a) prelevement avec une tige en verre quand L’ADN est tres concentré
b) Dans le cas d’une solution diluee on recupere le precipité par centrifugation
Quels sont les avantages du fluorometre qubit?
1) meilleur quantif de l’ADN
2) avec des colorants
3) Les contaminants ne reagissent pas avec l’ADN
Dans quel cas utilise t-on du CTAB?
Pour les tissus vegetaux riches en polysaccharides qui sont difficles a eliminer
Que fait le CTAB?
il se complexe avec l’ADN ainsi apres une centrifugation il se retrouve pprecipité avec l’ADN au fond du tube
Quelles sont les 4 grandes d’enzymes utilisees pour manipuler l’ADN?
1) nucleases
2) ligases
3) polymerase
4) enzymes de modifications
Un systeme de restriction/modification comporend ?
Une ennzyme de restriction + methylase
Quel est le role des endonucleases de restriction ?
detruire l’ADN des organismes etrangers
comment les bacteries se protegent des endonucleases ?
Avec des methylases qui methylent A ou C qui sont reconnues par l’endonucleases
Quel type d’enzyme de restriction est un homodimere?
type II
Quel type d’emzyme est un heterodimere ?
Type III
Quels sont les cofacteurs du type I?
ATP,Mg++,SAM
Quels sont les cofacteurs du type II ?
Mg++
Quels sont les cofacteurs du type III ?
Mg++,SAM
Quelles type d’enzymes de restriction ne sont pas utiles pour les recombinant et pourquoi?
le type I et III car leur site de clivage est loin du site de reconnaissance
Quelles extremites generent les enzymes de restrictions ?
5’-phosphate et 3’-OH
C’est quoi des enzymes de restric isoschysomere ?
reconnaissent la meme sequence mais ne coupe pas entre les memes bases ?
trois types d’extremites peuvent etre generes lesquelles ?
bouts collants gauche ou droite de la symetrie et bouts francs
Que veut dire un bont francs ?
symetrique
Quel est le contenue de la solution d’arret d’une digestion ?
1) glycerol pour augemnter la densite
2) SDS pour denaturer l’enzyme et dissocier le complexe ADN-enzyme
3) EDTA pour chelater le Mg++
4) Bleu de bromophenol un colorant permettant de suivre l’electrophorese
dans quelle phase, conditions et quelle direction est effectue la synthes des oligonucleotides?
phase solide dans un solvant non-acqueux comme l’acetonitrille et contraire a l’ADN donc 3’ vers 5’
Quel type de sllvant est neccessaire pour la syntheses des oligonucleotides et donne un exemple ?
les solvants non aqueux comme l’acetonitrile
Quelle peut etre la taille des oligonucleotides ?
jusqu’a 250 nucleotides
Quelle est la particularité des oligonucleotides obtenus du point de vu extremité?
leur extremité 5’ n’est pas phosphorylé il possède un OH
Combien de temps prend la synthese d’un njucleotide ?
3min/nt
Quelles sont les 4 etapes de synthese d’un oligonucleotide et leur fonctions?
-detritylation: deprotection de la fonction 5’OH pour enlever le groupement DMT par ajout d’acide trichloroacetique
-activation et addition : activer le groupe phosphorescent du 2e nt par addition de tetrazole pour creer un lien de type ester
- capping: acetylation des groiupement OH libre par l’anhydre acetique
-Oxydation en presence de H2O et I2 pour conversion du lien phosphite trivalent en phosphotriester pentavalent
A quoi sert l’etapde de capping ?
eliminer les oligonucleotides qui n’ont pas reagit
Qu’est-ce qu’un oligo degenere ?
Ajouter 2 nucleotides lors de l’etape d’addition au lieu d’un seul
Dans les puces d’ADN, qu’est-ce qui permet d’enlever le groupe protecteur ?
la lumiere ultraviolette
Quels sont les facteurs a considerer dans l’optimisation de la sequenece d’un gene synthetique ?
-utilisation des codons(+ ou - reprsentes)
-eviter la presence de regions repetees pour eviter le chevauchement des séquences
-eviter les regions riches en G+C ou A+T
-eviter que certains ARNm forment des structures secondaires
-eviter sites d’epissage
Quel est le premier genome qui a été synthétiser ?
le virus de la polio
comment faire un isolement d’ARN cellulairre total?
Lyser les cellles dans du thiocyanate de guanidium+B-mercaptoethanol pour inactiver les RNAse et centrifuger. l’ARN est beaucoup plus dense que les ADN et les proteines
quelles sont les plus grande source de RNAse ?
nos mains et les equipement qu’on va utiliser(passer au four pasteurn le materiel de verre) ou tiliser du plastique
Quelles sont les raisons pour lesquelles ont veut synthetiser de l’ADNc?
-Simplisfier l’analyse des genomes eucaryotes
-etudier l’epissage alternatif
-exprimer un gene eucaryotique chez un procaryote
-etudier le niveau et la variation d’expression des genes
Quel est l’inhibiteur connu des RNAse?
le diethylcarbonate
Pourquoi l’ARN est plus sensible a la degradation que l’ADN?
a cause de son groupememnt 2’OH qui est tres nucleophile
Comment est purifie l’ARNm polyA+?
chromatographie sur colonne d’oligo-dT
Quelles sont etapes de la synthese du premier brin d’ADNc?
utilisation de transcriptases reverse pour faire un hybride ADN-ARN
D’ou proviennent les trannscriptases reverses utiliser pour la synthese de l’ADNc?
Des retrovirus
les transcriptases inverse ont des RNAse H. Quel est l’effet?
degrade des nucleotides de l’hybride ADNc-ARN ce qui fait un manquement dans les premieres bases
Quelle est la seule methode permettant de produire des ADNc pleine longueur? et pourquoi?
la methode des amorces-adaptateurs car elle permet de generer des extremites collantes
Que fait la terminal transferase ?
ajoute une vingtaine de C a 3’ du premier brin d’ADNc
A partir de quel cycle la taille des fragments est precise ?
3e cycle a 72 degré
quelles sont les 3 methodes d’analyse des produits PCR standard?
1) electrophorese sur gel
2) sequencage
3) clonage
Quel est l’avantage du PCR multiplex?
analyser plus d’un amplicon dans une meme reaction en utilisant plusieurs paires d’amorces specifiques qui produisent des amplicons tailles differentes
A quoi sert la RT-PCR?
1) étudier le niveau d’expression des genes specifiques
2)analyse des ARNm peu abondants et les genes exprimes dans une seule cellule
Quand est-ce que le taux d’erreur de la Taq devient problématique ?
lorsqu’on doit utiliser les produits du PCR pour cloner
quel est la particularite des produits PCR de la Taq polymerase et quelle est son avantage ?
elle ajout un A a. l’extremite 3’ ce qui peut etre utiliser pour cloner
-TA cloning
-topocloning
-Ajout de site de restriction a l’extremite en utilisant des amorces contenant ces sites en extension
Pourquoi le clonage et la PCR sont importants ?
-Ils produisent des echantillons purs de genes individuels
-l’ensemble des clones contiennent de nombreuses molecules recombinantes differentes mais chaque clone contient de multiples copies d’une seule molecule
Une unité d’Abs a 260nm correspond a quelle concentration d’ADN double brin?
50ug/ml
Quel est le contenue des tampon de reaction?
Tampon
Mg++
sel pour maintenir la force ionique
L’albumine de serum bovin pour stabiliser l’enzyme
le DTT un agent reducteur
Quel est le contenu de la solution d’arret dun reaction ?
-Glycerol 50% pour augmenter la densité
-EDTA 50mM pour chelater le Mg++
-SDS 0,5% pour dentaurer l’enzyme et dissocier le complexe ADN/enzyme
-Bleu de bromophenol 0,05% pour suivre l’electrophorese(10ul par 50ul de reaction)
qu’est-ce que le sequencage a l’aide des capillaires ?
cest une gel visqueux qui permet de:
- separer les fragments d’ADN differents de seulement 1 nucleotides jusqu’a 1000 fragment
-utilise une marqueur fluorescent qui permet de detecter les cellules dans la fenetre de quartz
Quelles sont les methodes de Visualisation des fragments d’ADN?
-Coloration au bromure d’éthidium et visualisation sous éclairage U.V. (sensibilité: >1 ng d’ADN/bande)
-Autoradiographie ou phosphorimaging des fragments d’ADN marqués au 32P, 32P ou 35S (très sensible ≈ 10-12g d’ADN).
-Coloration avec des fluorophores non mutagènes comme le SYBR Gold ou Green et visualisation sous uv ou visible. 5 fois plus sensible que EtBr 1pg
Quelles sont les limites de la coloration par bromure d’ethidium ?
-doit etre complexe avec ADN pour fluorer
- Cause des mutations dans l’ADN car UV
Quelles sont les avantages de faire la visualition de l’ADN avec la methode SYBR gold ou green ?
-5 fois plus sensible que celle a l’EtBr
-pas de dimere de thymine
-Une lumiere suffit
Comment agit le bromure d’ethidium?
il s’intercale entre les bases et l’intensité des bandes detectees est fonction de la longueur des fragments
Comment detecte-t-on les frangements d’ADN marqués avec un isotope?
Par autoradiographie avec un film sensible aux rayon X. apres 10-12h les bandes d’ADN vont se coller au film
Comment se déplace l’ADN dans le gel?
Il s’infiltre par ses extremites et serpente a travers les pores du gel
C’est quoi l’electrophorese en champ pulsé PFGE ? la plus commune
electrophorese avec changement de polarité
Quel est l’avantage de l’electrophorese en champ pulsé?
peut separer les fragments jusqu’a 10Mb ce qui correspond a presque toutes les bacterie et les eucaryotes cependant il ne peut separer les chromosomes des mammiferes 50Mb
Comment preper de l’ADN de haut poids moleculaire pour l’analyse par PFGE?
- l’ADN ne doit pas etre mis en solution
-Si desirer les blocs d’agarose contenant de l’ADN peuvent etre traite avec des ebzymes de restrcitions pour voir la differences entre les fragments plus petits
Que permet de faire le Bioanalyser ?
analyser en quelques minutes des echantillons d’acides nucleiques et de proteines par electrophorese
Comment fonctionne le bioanalyzer ?
Durant la preparation, des micro-canaux sont remplis d’un polymere et d’un colorant fluorescent. Les complexes acide nucleique-colorant sont detectes par un laser fluorescent
Quels sont les avantages du bioanalyzer ?
-sensibilite tres petite de 0,02ng d’ADN/bande ce qui permet d’utiliser seulement 1ul d’ADN
-Un ordinateur mesure la taille des fragments et leur concentration
- permet de savoir si les fragments de la taille et concentration desirees ou si y’a des contaminant
Quel est la limite du bioanalyzer ?
Taille maximale des fragments = 12kb
Que permet les techniques de transfert Southern et d’hybridation(analyse southern)?
identifier les bandes dans un gel contenant une sequence specifique avec une membrane hybridee avec une sonde radioactive et une sequence specifique simple brin. Au cours de l’hybridation, la sonde s’apparie avec l’ADN cible sur la membrane et lesfragments hybrides sont identifies par autoradiographie ou phoosphorimaging
Quelles sont les applications des puces D’ADN?
-genotypage des multiples regions genomiques afin de detecter les polymorphisme
- etude des changements d’expression des genes
Quelles sont les methodes experimentales pour cartographier des molecules d’ADN de petite taille?
-Digestion avec plusieurs enzymes en meme temps et analyse sur electrophorese (+commun,rapide)
-Digestion partielle d’une molécule d’ADN marquée à une seule extrémité (si l’enzyme coupe a +ieurs endroit ou pour molecules longues)
Definition polymorphisme
variation de sequenes entre les individus d’une meme espece (fréquence >1%)
Quels sont les types de polymorphisme ?
SNP single nucleotide poly
RFLP restriction fragment length poly
STP pour short tandem repetitions
Les facteurs de la SNP?
1SNP a tous les 300pb
propre a chaque groupe ethnique
dans les regions intergenique
aide a localiser les genes lies au maladies car varition d’un seul nucleotide
Facteurs des RFLP?
-modifie le patron de coupure des enzyme de restriction
- Les marqueurs RFLP se comporte comme des marqueurs genetiques dans les croisement ce qui permet de savoir si gene lies ou non
comment sont genotypes les polymorphismes WGAS pour comparer les differents SNP?
a l’aide puces d’ADN
Qu’est-ce qui rend l’oligo resistant au nucleases?
le phosphorothionate
Les oligonucléotides peuvent être utilisés comme:
-sonde
-amorce
-linkers et adaptateur
-sequences unique
Transcriptases inverses disponibles:
- AMV (virus de la myéloblastose aviaire)
- M-MLV (virus de la leucémie murine de Moloney).
Entre ces deux premières enzymes, on préfère l’enzyme M-MLV car son activité RNase H est plus faible.
-SuperScript II (BRL), Cette enzyme a été modifiée en introduisant des mutations ponctuelles dans le site actif de la RNase H. SuperScript II est une enzyme de choix pour la synthèse de l’ADNc. Elle est active jusqu’à 55 °C ce qui permetg d’eliminer les structrures secondaires de l’ARMm qui bourraient bloquer la synthese d’ADN.
quelle est la particularité de la methode d’auto-amorcage ?
l’extrime 3’-OH fait une stricture en epingle a cheveux qui sert d’amorce pour synthetiser le deuxieme brin avec POL I de e coli et coupure avec la nuclease S1
quelle est la particularité de la methode de Gubler et Hoffman?
la RNAse H fait des casssures. les reisidus d’ARN servent d’amorces pour la synthese du deuxieme brin puis ligature
methode des amorces-adaptateur?
Après hydrolyse du brin d’ARN, on ajoute une queue de poly (dC) au groupement 3’ hydroxyle à l’aide de la transférase terminale. Cette queue est ensuite appariée avec un oligo (dG), qui servira d’amorce pour la synthèse du deuxième brin de l’ADNc.
Quelles sont les composantes typiques d’une reaction PCR?
ADN
Amorce 1 et 2
tampon tris-hcl
mgcl2 et KCl pour la specificite des amorces
des Nucleotiques A T G C
L’ADN pol thermostable
definition de la Tm
temperature a laquelle on retrouve 50% des amorces appariees et 50% non appariées
quels sont les facteurs qui affectent la Tm et la stabilites des hybrides ADN/ADN lors de l’appariement des amorces ?
-la force ionique: si on augmente la force ionique on favorise la stabilite
-composition en base des amorces: la stabilite des hybrides augmente avec le % en G+C car GC s’apparie 3x plus que AT donc plus GC augmente plus la Tm augmente
-plus de base plus de Tm
-l’ajout d’agent destabilisant comme le DMSO reduit la Temperature de fusion surtout pour les long pcr
comment calculer la Tm?
4x (G+C)+2x(A+T)
les deux methodes pour détecter le produit qPCR et leur particularité?
-SYBR Green: pas besoin d’oligo, emet de la fluorescence quand lie a l’ADN double brin ainsi on mesure la quantite totale d’ADN
-Sonde reporteR: cours oligo qui fluorece apres hybridation specifique a la sequence cible. 2 etiquette par sonde 3’quencher(Q) et 5’molecule fluorescente(R). pas de fluorescence quand Q et R sont a cote. TAQ pol degrade la 5’ ce qui libere R qui fluorescence
quelles sont les limites du SYBR Green en qPCR?
la fluorescence n’est pas specifique a l’amplicon produit
