Exam 2 Flashcards
Que signifie le mot ‘’vecteur’’ dans vecteur de clonage et vecteur d’expression
Plasmide
Utilité d’un vecteur de clonage
-faire des copies du plasmide
-permet de conserver un gène
-permet de faire des modifications et des mutations
-permet de les introduire dans les cellules
-permet de caractériser(rôle/fonction) les gènes
Utilité vecteur d’expression
-permettre l’expression du gène inséré(insert)
Quelle protéine spéciale produisent l’es plasmide PGex
Proteine GST (permet purification des proteine recombinantes)
Qu’est ce qu’une protéine de fusion
Protéine qui est fusionner avec autre chose (ex= le GST collé avec RecP1)
Le PGex avec avec le RecP1 forme une ou deux proteine
1 grande
Qu’est ce qu’une étiquette
C’est un domaine de fusion, l’endroit qui précède le gène d’intérêt. Dans le lab, l’étiquette est GST
Utilité des protéines de fusion
-facile a purifier
-augmente la solubilité des protéines recombinantes
-simplifient la détection spécifique
-favorise la sécrétion de la protéine dans le périplasme
-contiennent souvent un site de clivage spécifique pé une protéase (sépare l’étiquette et la proteine/ADN d’intérêt
Qu’est ce qu’un site de clivage
Un endroit entre l’étiquette et la protéine d’intérêt ou on peut decouper, donc les séparer
Qu’est ce que la Thrombin
-c’est une enzyme
-ce NEST PAS une enzyme de restriction
-elle coupe à la fin du GST
Chaque codons est un code pour faire
a) une proteine
b) un acide aminé
b) acide aminé
GST est une proteine ou un promoteur
Une protéine
Quelle est la fonction du GST
-catalyse bcp de réactions
-affinité très forte avec le glutathion (formé par 3 acides aminés) tripeptide
Pourquoi faire une 2e transformation bactérienne
-avec une nouvelle souche de EColi BL21
-but= produire la protéine d’intérêt
Avantages de EColi BL21
-inactivation des proteases
-croissance rapide
-usine à protéines
Différence entre promoteur inductibles et constitutifs
-constitutifs= exprimés en tout temps
-inductibles=n’est pas exprimé en tout temps
Rôle d’un promoteur
-facilite l’expression des gènes en attisant sur la transcription de ceux-ci.
Qu’est ce que lacI
C’est un gène qui code pour la protéine Répreseur. Elle est toujours transcrite, car son promoteur est constitutif
Comment se cré le GST
-le gène du GST code pour la formation de la proteine GST lorsque le promoteur inductible tac est activé. Dans EColi, il faut du IPTG pour l’activé et non du Lactose, car le Lactose est un sucre et EColi aime le sucre, son son action serait de plus en plus faible à force que EColi en consommerait.
Qu’est ce que lac opéron
Quelque chose qui permet de produire les enzymes juste quand il y a du Lactose(ou IPTG) autour d’elle
Quel est le rôle de Répresseur
-c’est un peu comme un bloc lego qui se fixe sur le promoteur et empêche l’enzyme polymerase de transcrire le prochaines gènes (obstacle physique)
À quel moment le promoteur inductible doit s’activer dans EColi
1-courbe exponentielle
2-phase stationnaire
3-phase de déclin
-au milieu de la phase exponentielle, car c’est l’endroit où il y a une abondance de ressources pour les bactéries et elle sont maintenant assez nombreuses pour produire beaucoup de protéines.
Qu’est ce qu’un cardée de lecture
C’est une séries de paires de 3 nucleotides qui codent pour des acides aminés différents
Codon de départ ?
Aug=met
Codon d’arrêt ?
UAA,UGA,UAG
Quel est le départ de notre cadre de lecture dans le labo
C’est la protéine GST qui précède la protéine d’intérêt
Dans le lab, devons nous ajoute les codons d’arrêt dans notre PGex
Non, l’industrie les a déjà ajouté
Combien de cadre de lecture sont possibles
3, car il y a 3 lettres par codons
A partir de l’étape du lysat cellulaire, pourquoi il faut toujrosu garder nos protéines dans la glace ?
Car elle sont fragiles, donc un petit excès de chaleur entraînerai la dénaturation et la dégradation des protéines
Que fait le lysozyme
C’est un enzyme qui dégrade la paroi de peptidoglycan (lyse)
Que fait le Triton
C’est un détergent qui solubilise les protéines afin de les extraire de la membrane
A quoi sert le DNase et le RNase
À digérer l’ADN et l’ARN (chimiquement), car elles sont visqueuses, donc elles nous empêchent de recueillir un maximum de protéines.
Que fait le sonicateur
C’est un ultrason qui a un effet mécanique. Il pulvérise l’ADN restante et finalise la lyse pour extraire les protéines
Pourquoi, entre les 3 sonicafication, il faut remettre les protéines au froid ?
Pour éviter qu’elles se dénaturent
Avec quelle technique purifie-on les proteine d’intérêt ?
Une chromatographie d’affinité
Nomme 2 étapes importante de la purification
-le lavage (des autres composés)
-l’élution (pour obtenir la protéine de fusion purifiée)
Que met on en excès pour que le GTS se décolle de la bille
On met du glutathion libre en excès, donc le GST se décolle du gluthation de la bille pour aller vers le glutathion libre.
Qu’est ce que le dosage des protéines ?
C’est mesure/quantification de la qté de protéines purifiées obtenues
À l’aide de quel comparaison fait on le dosage ?
Avec une courbe standard qui sert d’étalon
Sur la droite du dosage, quel points sont les plus fiables ?
Les points au centre
puisque ce ne sont pas tous les points qui sont fiables, on ne peut pas en faire une moyenne
Pourquoi fait on 3 dilutions au cours du dosage
Pour s’assurer qu’un des 3 échantillons offrent un point fiable (un point au centre de la droite)
Si on se trompe, peut-on refaire seulement la courbe d’échantillon ou bien il faut aussi refaire la courbe standard ?
Il faut refaire les deux courbes, car on ajoute des réactifs dans les tubes, ce qui fait des réactions chimiques. Alors, tout doit vieillir en même temps
Pourquoi doser les protéines (2 raisons)
1-pour s’assurer qu’on va voir quelque chose sur le gel(assez de matériel pour obtenir une bande visible)
2- pour s’assurer qu’on dépose la même qté de protéines dans chaque puit. Cela facilite l’étude des facteurs influents, comme la température ou la résistance à un antibiotique.
Pk une bactérie qui a un génome très différent de l’humain peut parvenir à synthétiser une molécule complexe provenant de l’humain
-cela s’explique par le fait que le code génétique (ATUGC) est universel.
Que contient le tampon d’élitismes ELU lors de la purification des protéines ?
Il contient du glutathion en excès
Que signifie le C de GST-C
Qu’il s’agit de la protéine purifié
Que sont les protéines BSA
Ce sont nos étalons
Que fait un spectrophotomètre ?
Il mesure l’absorbance des échantillons
Pk on utilise un tampon d’élitismes sans glutathion lors du dosage
Car il ne faut pas qu’il y ait déjà des protéines présentes (le glutathion)
Que sont les tubes avec une étoile *
Ce sont des tubes dilué de l’échantillon purifié
