Exam 1 Flashcards
Nomme étape production proteine
1.amplification ADN par PCR
2.de gestion enzymatique=coupure des liens avec des enzymes de restriction
3.clonage= ADN d’intérêt est inséré dans le plasmide
4.transformation bacterienne=insertion du plasmide dans une bactérie
A quoi sert la technique PCR
-à amplifier et à sélectionner l’ADN d’interet( un gène en particulier)
Nomme les 3 cycles du PCR
- Denaturation= chauffage= brise pont-H
2.hybridation=refroidissement=ajout d’amorce
3.élongation= ajout de nucleotide
Cycle 2:
1.production de 4 molécule
Cycle 3:
1.production de 8 molécule
-c’est à ce cycle que la première ADN cible est créé
Élément nécessaire à l’amplification en chaîne polymérisé
-une matrice d’ADN
-2 amorce
-un mélange des 4 nucleotides
-un ADN polymérase (taq)
-un tampon
-du mgcl2
Rôle de l’amorce
- Déterminé début/fin de la chaîne
2.permet à l’enzyme de s’accrocher au brin
Avantage du TAQ
-il est stable à haute température(ne se dénature pas)95 degré
-il agit longtmeps (1h)
A la fin des cycles, y a t’il plus de copie d’ADN ciblé ou bien d’ADN pas encore ciblé
Il y a plus de copie ciblé
Caractéristiques d’un plasmide
-ADN circulaire
-tres petit
-extra-chromosomique
-réplication autonome
-contient que quelque gènes(ex=gène de résistance aux antibiotiques)
-seulement dans quelques bactéries
Composantes de bases d’un plasmide
1.origine de réplication
2.site de clonage multiple(endroit où on insère le gène)
3.un gène de selection(ex=résistance à l’antibiotique(AMPR))
Qu’est ce qu’un enzyme de restriction
-enzyme qui coupe à un endroit précis
-forme des extrémités covalentes( extrémités à simple brin qui peuvent adhérer à d’autre extrémités)
Qu’est ce qu’un bout franc
-extrémités qui n’est pas cohesives( pas de simple brin)
Nomme les deux types de liaison coupé par l’enzyme
-pont H
-liaison covalente(phosphodiester)
Rôle de l’ADN ligase
-lie deux extrémités cohesives ensemble (extrémistés qui ont été coupé par le meme enzyme de restriction)
-deux extrémités sont non cohésives sur la séquence de leur paire de bases ne sont pas complémentaires
Qu’est ce que le clonage
-insertion de l’ADN amplifier dans le plasmide (devient un PLASMIDE RECOMBINANT)
Explique ce qu’est l’étape de transformation bactérienne
-insertion d’une plasmide recombinant dans la bactérie
Qu’est ce qu’un insert
Un gène sélectionné que nous voulons intégré dans un microorganisme
Nomme les 3 techniques de recombinaison génétique chez les bactéries
1.transformation
2.conjugaison
3.transduction
Qu’est ce qu’une bactérie compétente
C’est une bactérie qu’on a traité pour qu’elle soit capable d’accepter de l’ADN étranger(pour se faire, on cré des pores dans la membrane et l paroi)
Dans le labo, on va insérer quoi ? Et dans quelle type de bactérie
Un plasmide dans la bactérie Escherichia coli DH5alpha
Avantage de la bactérie utilisée pour notre laboratoire
-croissance rapide
-certaines endonucleases inactivés= impossibilité de couper le plasmide qu’on va insérer
-une véritable usine à plasmide
Quelle est la technique inspiré de la transformation bactérienne que nous allons utiliser dans le labo?
-la méthode du choc thermique=glace/chaud/glace
-glace 1= diminue fluidité et devient plus collante
-chaud= moins collante et augmente fluidité et ouvres les pores de la paroi et de la membrane de la bactérie
-glace2= pores se referment, les phospholipides ne bougent plus, l’ADN entré ne peux plus ressortir
Qu’est ce que ça change à une bactérie de faire de la transformation
-modifie les caractéristique d’une bactérie par l’absorption d’un ADN présent dans le milieu
Explique c’est qu’est le criblage
-c’est une technique de double sélection
-on note la présence d’un plasmide recombinant (ou bien son absence)
-on note la présence d’un gène interrompu(ou rester intact)
-si le gène est intact (pas de plasmide) le produit est de couleur BLEU
-dans notre cas, on cherche alors les produits de couleur blanche(couleur qui montre qu’un plasmide a été ajouté )
Qu’est ce qu’un facteur recombinant
-c’est un gène transmis qui change les caractéristiques du sujet à l’étude (ex=souris qui meurent)
Explique la recombinaison génétique par conjugaison
-méthode sexuée des bactéries pour s’échanger leurs informations génétiques
-pilus = agit comme un penis
Explique recombinaison génétique par transduction
-transfert de matériel génétique par l’intermédiaire d’un vecteur viral(un virus)
-on nomme le virus= BACTÉRIOPHAGE
Pourquoi conserver les bactéries dans un milieu avec antibiotiques même après avoir obtenu nos colonies ?
-car sinon les bactéries éjecterait le plasmide quelle viennent d’acquérir pour ne pas conserver quelque chose qui ne leur sert pas
A quoi sert l’étape de la miniprep
-elle sert à purifier l’ADN plasmidique
En quoi consiste la technique de miniprep
-à extraire un petite quantité d’ADN plasmidique ayant subi une transformation
Non de la technique de miniprep
-adsorption sur une membrane de gel de silice
Étape de la miniprep
-lyse des cellules avec un detergent( il déstabilise la membrane de phospholipide)
-NaOH(ajout brutal)= dénature les protéines, l’ADN génomique et l’ADN plasmidique= il y a formation de précipité
-centrifugation avec tube de silice= les sels créer adhèrent par adsorption sur la silice. Les bactéries colle au paroi du tube
-on lave ensuite les impuretés avec des
Buffet, puis on les jetent
-finalement, on élue les bactéries pour les recueillir et les mettre sur la glace
En quoi consiste l’étape de digestion enzymatique
-coupure de l’ADN plasmidique purifié avec des enzymes de restrictions, puis analyse de cet ADN sur gel d’agarose
Nomme les deux rôles des enzymes de restriction
1-clinage moléculaire
2-pour vérifier si le plasmide correspond à ce qui est attendu
-taille
-quantité
-sens de l’insert
Utilité des enzymes de restriction pour les bactéries
-elles sont le mécanisme de défense immunitaire des bactéries contre leur phages
Comment ?
-en méthylant certaines bases
-en n’ayant aucun site de restriction possible
Est ce que les deux brins doivent être méthylé pour servir de protection
-non, un seul brin suffit
Quel est l’enzyme de restriction utilisé dans notre laboratoire.
-EcoRI
Comment on appelle le processus lors duquel on coupe une seule fois le plasmide circulaire
-linearisation
Comment peut on contrôler le sens de l’insert et s’assurer qu’il n’y aura qu’une seule possibilité
-en utilisant 2 enzymes de restrictions différentes qui forment des extrémités cohésives différentes
Pourrait t’il y savoir plusieurs site de clonage sur un plasmide
-non sinon il serait briser en plusieurs segments
Peut il y savoir plusieurs site de restriction sur un ADN GÉNOMIQUE
Oui, sans problème
Est ce que plusieurs plasmide d’ADN recombinant peuvent être créer
Oui, si pas deux enzymes différentes
