Espectrofotometría Flashcards
Espectrofotometría
Técnica basada en la capacidad de ciertas sustancias de absorver y emitir luz selectivamente de ondas electromagneticas de una longitud de onda específica
La energia de una onda electromagnetica está dada por:
E=hv donde E es energia H es la constante de planck 6,626 x 10^(-4) y V el número de ondas
Absorvancia
Medida de la cantidad de luz absorvida
Transmitasa
Medida de la luz que es transmitida. Recordemos que las moleculas absorven o dejan pasar la luz, es decir la trasnmiten
Que cosas tiene una onda
Longitud de onda y frecuencia, siendo la longitud de onda la distancia entre dos puntos de la onda. Recordar que a mayor longitud de onda menor energia. A menor longitud de onda mayor energía
Ecuación de la energía
E=n x v
Rango de. Edicion de la espectrofotometría
Es del espectro visible. Va desde los 400 micrometros a los 700 micrometros
Cromóforos
- Moléculas coloreadas
- Capaces de absorver luz
3.tiene electrones pi - Tiene electrones no enlazantes que pueden pasar de su estado basal a un nivel energético mayor
- Tiene enlaces conjugados lo que le da capacidad de absorver
Que se usa para poder medir la concentración de proteínas en un espectrofotómetro (tinte)
Azul de comassie. Permite cuantificar proteínas, reaccionando con ella y formando un complejo proteína-reactivo, con este se puede hacer cuantificacion de la absorcion de luz
Reactivo de bradford
Es el azul de comassie
Que requiere una proteina para que se le pegue el reactivo de bradford
Residuos basicos u aromáticos. Es en estos donde se une el azul de comassie
Espectroforómetrp
Instrumento utilizado para cuantificar la absorvancia. Sus partes son
1. Fuente luminosa: emite muchas ondas de luz
2. Selector de lo gitud de onda: elegie 1 onda de luz a trabajar
3. Cubeta: contiene la sustancia. Además, va a dejar pasar (transferir la luz)
4. Sistema fotométrico: mide la transmitasa y la transforma a absorbancia
Cual es la relaciom matemática de la absorvancia?
Tiene una relacion directamente proporcional con la concentración de una sustancia. @=Elc
E y L son una constante entonces A=kxc siendo C la concentración.
E: absorvidsd molar
L: espesor de las paredes de la cubeta.
Los valores de absorvancia van entre 0 y 1
Espectro de absorción
Es un gráfico propio de cada sustancia que relaciona la absorvancia (y) con la longitud de onda (x). Debe,os elegir la longitud de onda con mayor absorvancia, es decir la longitud de onda máxima lo que llamamos LONGITUD DE ONDA DE TRABAJO
Que es la longitud de onda de trabajo
Es la longitud de onda máxima, es decir, la longitud de onda en la que una sustancia tiene mayor absorvancia
Pasos para hacer espectrofotometría
- Determinar longitud de trabajo
- Usar curva de calibración
- Determinar la concentración de la muestra problema
Curva de calibración
Grafico que relaciona la absorvancia con las concentraciones. Deben ser conocidas.
Cosntruccion de una curva de calibracion
1. Preparar 5 puntos de la sustancia a cocentraciones crecientes mediante tecnica de disolución C1v1=C2V2. Incluir un tubo sin muestra en el medio el que es llamado tubo blanco
Recordar que en cada baso vamos a mantener el volumen total. Medimos el volumen en microlitros
2. Determinar la absorvancia de cada tuvo
3. Construir curva de calibración (relación de absorvsncia y de concentrscion)
4. Determinar la concentración por medio de la absorvancia y la curva de calibración
A) por interpolación
B)ecuación de la recta que la da el exel y reemplazar. Y=mx+c
Nombre las lartes de una micropipets y su funcion
- Botón de accionamiento: absorve y dispersa liquido
- Rueda de ajuste de volumen: ajustar el volumen girando la pelotita
- Indicador de volumen: muestra el volumen a aspirar
- Eyector de la punta: su función es eyectar las puntas
- Soporte de puntas: proporciona, ajuste a las puntas que contienen el volumen del líquido requerido
Clasificación de las micropipetas
Micropipetas de volumen fijo
Micropipetas de volumen variable
Clasificación según número de csnales
Monocanal
Multicanal: ventaja: reducen la carga ce ñas micropipetas monocanal
Funcionamiento de las micropipedas de desplazamiento de aire
Embolo en el pulgarb
Suelto
Pongo punta desechable con liquido
Presiono el embolo
Suelto el liquido
Posición 1
Posición de reposo
Colocar punta adecuada seguj el volumen y hacer presion
Posición 2
Aspirar líquido hasta el primer tope. Sumergir la punta en el líquido, soltar y aspirar. Se llena el voluemen establecido
Posición 3
Presiono el embolo, se disperza liquido. Al primer tope se vacía el líquido y al segundo se vacía toda la pipeta
