Épissage de l’ARN

Question 1

Chez qui se produit le processus d’épissage?

Answer 1

Seulement chez les eucaryotes, car les procaryotes possède une séquence codante continue. Ils n’ont pas d’introns donc pas besoin d’épissage.

Question 2

Qu’est-ce que la maturation de l’ARN?

Answer 2

– Formation de la coiffe à l’extrémité 5’ (vu par S. Guérin)
– Épissage (ce qu’on voit aujourd’hui)
– Polyadénylation à l’extrémité 3’ (vu par S. Guérin)

Question 3

Quelle est l’étape la plus complexe de la maturation de l’ARN?

Answer 3

L’épissage est l’étape la plus complexe des 3 mécanismes de maturation de l’ARN.

Question 4

Que se passe-t-il une fois l’ARN transcrit?

Answer 4

Une fois l’ARN transcrit (vu par S. Guérin), l’ARN eucaryote subit des modifications avant de l’exporter hors du noyau pour être traduit (sera vu par C. Salesse).

Question 5

Qu’est-ce qu’un exon?

Answer 5

Ce sont toute région maintenue dans l’ARN mature (codante ou non). Il existe des exons non codants: régions 5’ et 3’ non traduites.

Question 6

Que sont les séquences non-codantes chez les eucaryotes?

Answer 6

Les introns.

Question 7

Un gène correspond à quoi?

Answer 7

Il correspond à un ARNm épissé. En effet, après l’épissage il ne reste que les parties codantes (exons) ainsi que les extrémités.

Question 8

Combien y a-t-il d’introns en fonction du nombre d’exons?

Answer 8

Il y a toujours un intron de moins que le nombre d’exons, car les introns séparent les exons.

Question 9

Comment le nombre d’intons par gène varie?

Answer 9

Le nombre d’intron par gène varie énormément.

Il y a rarement plus d’un seul intron par gène dans la levure.

Plus l’organisme est complexe, plus il a d’introns.

Question 10

Comment caractériser la taille des introns et des exons?

Answer 10

Très variable
• Introns plus longs que les exons
• Exons environ 150 bases
• Introns jusqu’à 800 000 bases (800kb)

Exemple – Gène DHFR
• 31kb
• 6 exons = ARNm de 2kb
• Plus de 90% du gène est constitué d’introns

Question 11

Comment éliminer les introns?

Answer 11

La transcription ne reconnaît pas les introns. Les introns sont donc inclus dans le pré-ARNm.

La traduction se fait en continue et ne discrimine pas les introns et les exons. Il faut donc enlever les introns avant la traduction.

Une machinerie spécifique et très précise doit enlever les introns des pré-ARNm pour en faire des ARNm finaux. C’est l’épissage de l’ARN.

Question 12

Quelles sont les caractéristiques des séquences qui se retrouvent dans les introns à leur jonction avec les exons?

Answer 12

À la jonction intron/exon, il y a des séquences spécifiques conservées

• Le site d’épissage 5’ (donneur) correspond à une séquence GU
• Le site d’épissage 3’ (receveur) correspond à une séquence AG
• Le site de branchement possède un « A » dans une séquence précise (YNYURAY) suivi d’une séquence riche en pyrimidines (Y)

Question 13

Qu’est-ce que permettent les séquences spécifiques présentes dans un intron?

Answer 13

Cela permet aux mécanismes de le reconnaître et de l’enlever.

Question 14

Quelles sont les réactions du processus d’épissage?

Answer 14

2 réactions de trans-estérification successives (1ière et 2ième étape)

Question 15

Quelle est la première étape de l’épissage?

Answer 15

C’est la 1ère trans-estérification

Le 2’OH du A au site de branchement effectue une attaque nucléophile du phosphate de la G du site donneur.

Le 5’ libéré de l’intron se lie au A du site de branchement ce qui forme une jonction triple.

Question 16

Quelle est la deuxième étape de l’épissage de l’ARN?

Answer 16

C’est une 2ème réaction de trans-estérification

Le 3’OH de l’exon 5’ effectue une attaque nucléophile du phosphate de la G du site receveur. Cela forme une jonction de l’exon 5’ avec l’exon 3’.

L’intron en forme de lasso est rapidement dégradé.

Question 17

Qu’est-ce que l’épissage en trans?

Answer 17

Normalement, la jonction 3’ de l’exon 1 se lie avec le 5’ de l’exon 2 adjacent sur un même pré-ARNm.

Par contre cela peut également survenir entre 2 pré-ARNm distincts qui ne sont pas adjacents.

Ce mécanisme est plutôt rare.

Question 18

Pourquoi la majorité des fonctions de l’épissage sont réalisées par les ARN au lieu des protéines?

Answer 18

Parce que les ARN repèrent les séquences conservées aux jonctions intron/exon et participent à la catalyse de la réaction d’épissage.

Question 19

Qu’est-ce que le spliceosome? Quel est son rôle?

Answer 19

C’est un complexe d’environ 150 protéines et 5 ARN

Sa aille semblable au ribosome (donc très gros)

Sa fonction est l’hydrolyse de plusieurs ATP par épissage, ce qui nécessite beaucoup d’énergie.

Question 20

Quels sont les 5 ARN qui constituent le spliceosome?

Answer 20

Ce sont 5 petits ARN nucléaires (snRNA) : U1,U2,U4,U5 et U6

Ils comportent de 100 à 300 nucléotides

Question 21

Que sont les snRNP?

Answer 21

Les snRNA sont complexés avec des protéines. Le complexe ARN-protéines = petites ribonucléoprotéines nucléaires ou snRNP.

Question 22

Vrai ou faux? Le spliceosome implique beaucoup d’autres protéines ne faisant pas partie des snRNP.

Answer 22

Vrai.

Question 23

Quels sont les rôles des snRNP?

Answer 23

Reconnaissent le site d’épissage 5’ (donneur) et le site de branchement et rapprochent ces 2 sites

Catalysent les réactions de clivage et de ligation de l’ARN via des interactions ARN-ARN, ARN-protéine et protéine-protéine.

Question 24

Quels sont des exemples d’hybrides ARN-ARN?

Answer 24

Au site d’épissage 5’ (donneur) : U1 et U6 peuvent se lier par complémentarité

Au site de branchement : U2, BBP, une protéine non snRNP mais importante dans l’épissage

Les snRNP peuvent avoir une complémentarité entre elles : liaison de U2 avec U6

Question 25

Vrai ou faux? U6 est plus complémentaire que U1 au site d’épissage 5’ (donneur).

Answer 25

Faux. C’est le contraire. C’est U1 qui est très complémentaire.

Question 26

Quelle est la différence entre la complémentarité de BBP et de U2 au site de branchement?

Answer 26

BBP est très complémentaire

U2 est très complémentaire aussi sauf avec le A

Question 27

Quelle est la première étape de la mise en place de la machinerie de l’épissage de l’ARN?

Answer 27

C’est la formation du complexe E.

Le site d’épissage 5’ est reconnu par la snRNP U1

Une sous-unité de U2AF (65) se lie au site polyY et l’autre sous-unité (35) se lie au site d’épissage 3’ (receveur)

La sous-unité U2AF65 recrute BBP au site de branchement

Question 28

Quelle est la deuxième étape de la mise en place de la machinerie de l’épissage?

Answer 28

C’est la formation du complexe A

La snRNP U2 se lie au site de branchement (aidé par U2AF). Cela aura pour conséquence de déplacer BBP.

Le A est non-apparié avec U2 et devient donc disponible pour réagir avec le site d’épissage 5’ (donneur).

Question 29

Quelle est la troisième étape de la mise en place de la machinerie de l’épissage?

Answer 29

C’est la formation du complexe B.

Liaison de la particule tri-snRNP (U4-U5-U6) au pré-ARNm et à U1 et U2. U4 et U6 se lient à leur séquence complémentaire et U5 est lié par des interaction protéine-protéine.

U6 prend la place de U1 au site d’épissage 5’ (donneur)

Le complexe est alors complètement assemblé et prêt à catalyser l’épissage de l’intron

Question 30

Quel est le but de la formation du complexe B?

Answer 30

C’est de rapprocher U2 et U6, car ils sont complémentaires.

Question 31

Quelles sont les caractéristiques de la formation du complexe C?

Answer 31

U4 est libéré du complexe

Permet à U6 d’interagir avec U2. Cela juxtapose le site d’épissage 5’ (donneur) avec le site de branchement. Lorsque U2 et U6 se lient, il y a rapprochement des 2 sites et la première réaction d’estérification peut avoir lieu.

U5 facilite ensuite la liaison du site d’épissage 5’ (donneur) avec le site d’épissage 3’ (receveur)

Libération de l’intron sous forme de lasso

Question 32

Que sont des introns auto-épissants? Est-ce fréquent? Comment ça se passe?

Answer 32

L’auto-épissage est rare.

Ce sont des introns qui s’éliminent eux-mêmes sans ARN externe ou protéines

Le mécanisme implique que l’intron lui-même se replie en une configuration précise au sein du pré-ARNm et auto-catalyse la réaction d’épissage.

Souvent la présence de séquences complémentaires dans le pré-ARNm permet ce processus, car cela permet de rapprocher les sites.

Question 33

Quelle est la fiabilité de l’épissage? Quel est le problème?

Answer 33

Il y a une fiabilité de reconnaissance, car le site d’épissage 5’ est reconnu par 2 snRNP (U1 et U6). Il est donc peu probable qu’une séquence incorrecte soit reconnue par les deux. La sélection du site d’épissage 5’ est donc très stricte.

Problème
• Longueur moyenne de l’exon : 150 nucléotides
• Longueur moyenne de l’intron: 3000 nucléotides
– Certains font 800 000 nucléotides

La machinerie doit identifier les exons au sein d’un océan de séquences introniques. Des erreurs peuvent donc se produire.

Question 34

Quels sont deux mécanismes d’erreur de l’épissage?

Answer 34

1. Saut de sites d’épissage, donc on saute un exon
2. Sélection d’un pseudo-site. Les sites d’épissages sont petits et peuvent aléatoirement être retrouvés dans la séquence exonique.

Question 35

Comment on prévient les erreurs de l’épissage?

Answer 35

Les pré-ARNm sont épissés au cours de la transcription. En effet, l’ARN pol transporte des protéines jouant un rôle dans l’épissage de l’ARN. Ces protéines sont transférées de l’ARN pol vers le pré-ARNm quand il y a rencontre d’un site d’épissage 5’. Il y a alors recrutement rapide des protéines au site d’épissage 3’. L’assemblage du spliceosome se fait dans l’ordre que l’ARN est transcrit ce qui fait en sorte que le saut d’exon devient peu probable.

Reconnaissance préférentielle des sites d’épissage proches d’exons par des protéines SR. Des protéines SR lient des séquences « amplificateurs d’épissage exoniques » (ESE). SR recrutent U2AF au site d’épissage 3’ et U1 au site d’épissage 5’. Le spliceosome s’assemble préférentiellement aux sites voisins d’exons.

Question 36

À quoi servent les protéines SR?

Answer 36

Grande variété de protéines SR qui sont essentielles pour l’épissage correct.

Question 37

Quelles sont les caractéristiques du spliceosome mineur (AT-AC)?

Answer 37

C’est l’épissage avec une autre forme du spliceosome (plus rare).

U11 remplace U1et U12 remplace U2. Les séquences de reconnaissance sont aussi différentes.

U4 et U6 sont différentes.

U5 est le même

Séquences de reconnaissance aux extrémités des introns sont différentes
– AU en 5’ et AC en 3’, d’où le nom spliceosome AT-AC.

Les étapes sont identiques au système commun.

Question 38

Quelle proportion des gènes humains subissent un épissage alternatif?

Answer 38

Jusqu’à 75% des gènes humains subissent un épissage alternatif.

Question 39

Qu’est ce que l’épissage alternatif?

Answer 39

L’ARN peut être épissé par des voies alternatives pour générer des ARNm différents (plusieurs protéines (isoforme) par pré-ARNm).

La plupart donne 2 ARNm, mais ca peut être beaucoup plus
– Gène Slo humain = des centaines d’ARNm
– Gène Dscam de la drosophile = des milliers d’ARNm!!

Avec un même pré-ARNm on est capable de produire plusieurs ARNm et plusieurs protéines différentes ce qui permet d’enrichir le taux de protéines capables d’être produite par un même gène sans augmenter notre nombre de gène.

Question 40

Expliquez l’exemple de la troponine pour l’épissage alternatif.

Answer 40

L’ARNm primaire contient 5 exons et 4 introns.

2 ARNm alternatifs contenant chacun 4 exons

3 exons communs (1, 2 et 5)et 1 exon unique (3 ou 4)

Question 41

Quels sont les différents type d’épissage alternatifs?

Answer 41

Exon éliminé : donc sauté un exon

Exon allongé : on garde une partie d’un intron

Intron retenu : on conserve un intron

Épissage trans alternatif : 2 pré-ARNm se lient ensemble pour que l’ARNm contienne les 2

Question 42

Les épissages alternatifs sont ils des erreurs?

Answer 42

Non. Ce sont des événements contrôlés par la cellule.

Question 43

Donnez l’exemple de l’antigène T de SV40 pour l’épissage alternatif.

Answer 43

Lorsque non épissé, le codon stop dans l’intron produit une protéine tronquée à antigène petit t.

Antigène petit t est un cas d’allongement d’exon

La protéine SR (SF2/ASF) qui s’accumule dans l’exon 2 favorise l’épissage au site 5’sst et la production de petit t.

Voir diapo 42.

Question 44

Qu’est-ce que l’exclusion d’exons par encombrement stérique?

Answer 44

Dépend des positions relatives des sites d’épissage dans un intron ou de la taille d’un intron

Quand les introns sont trop petits il est impossible de lier toute la machinerie sur le site on ne peut pas former un spliceosome complet

Liaison de U1 empêche la U1 liaison de U2 sur le même intron

Liaison de U2 empêche l’utilisation du site d’épissage 5’ du même intron

Question 45

Qu’est-ce que l’exclusion d’exons par combinaison de sites d’épissage majeur et mineur?

Answer 45

Sites majeurs = GU – AG
Sites mineurs = AU – AC

Aucun spliceosome peut enlever un intron contenant une combinaison de sites mineur/majeur, car la machinerie est spécifique à l’un ou à l’autre et non aux deux.

Question 46

Comment fonctionne les amplificateurs exoniques?

Answer 46

Ce sont des activateurs qui aident le spliceosome à venir se lier.

Par exemple, les protéines SR possèdent un domaine de liaison à l’ARN ainsi qu’un domaine de liaison aux protéines de la machinerie d’épissage. Cela lui permet de recruter ces protéines au niveau d’un site d’épissage proche.

Question 47

Expliquez l’action des répresseurs exoniques (ou introniques) d’épissage.

Answer 47

Ils bloquent les sites et empêchent les spliceosome de s’y lier.

Les répresseurs exoniques (ou introniques) d’épissage sont dans la famille des hnRNP. Ils possèdent un domaine de liaison à l’ARN. Ils encombrent le site de liaison des protéines de la machinerie d’épissage.

Exemple: protéine HRP36 qui inhibe l’inclusion de variantes de l’exon 6 dans le pré-ARNm de Dscam

Question 48

Expliquez les 2 modes d’action de hnRNP1.

Answer 48

hnRNP1 est un répresseur d’épissage qui agit de 2 façons

1- Deux hnRNP1 se lient à l’extrémité de 2 exons et masquent l’intron. Le spliceosome ne peut pas se lier l’intron car il est masqué.

2- Un premier hnRNP1 se lie au site polypyrimidinique et lie d’autres hnRNP1 par un système coopératif. Le spliceosome ne peut pas lier l’intron car il est encombré.

Question 49

Qu’est-ce que l’édition de l’ADN? Quels sont les mécanismes impliqués?

Answer 49

On modifie la séquence d’un ARN après sa transcription et avant sa traduction

L’édition insère, enlève ou modifie des bases individuelles de l’ARN

Deux mécanismes impliqués:
– Désamination d’adénines ou de cytosines
– Insertion ou délétion d’uridine par un ARN guide

Question 50

L’édition de l’ARN par désamination se fait où et comment? Donnez un exemple.

Answer 50

Se fait dans certains tissus et de manière contrôlée

Exemple: apolipoprotéine-B, le codon CAA subit une désamination du C pour donner un UAA (codon stop!). Dans le foie, il ne subit pas de désamination ce qui donne au final une certaine protéine qui a des fonctions spécifiques pour cet organe. Dans les intestins, ce codon subit une désamination donc la protéine synthétisée est plus petite et possède des fonctions spécifiques aux intestins.

Question 51

L’édition de l’ARN par désamination se fait sur quelles bases? Par quelle enzyme?

Answer 51

Elle se fait sur des cytosines ou des adénosines.

C’est un phénomène plutôt rare, mais important. Par exemple, la drosophile a seulement 20 cytosines modifiées

Les désamination se font par une enzyme nommée la ADAR = Adenosine deaminase acting on RNA

Les désaminases reconnaissent une séquence spécifique ou une structure secondaire particulière de l’ARN

Question 52

L’inosine est reconnue comme quel groupement durant la traduction?

Answer 52

L’inosine est reconnu comme une guanine lors de la traduction.

Question 53

Quel est le principe de l’édition de l’ARN par insertion de U?

Answer 53

Ce processus se fait dans les mitochondries de trypanosomes

De multiples U sont insérés après la transcription

Représentent jusqu’à la moitié des nucléotides de l’ARN mature

Ex: insertion de 4 U dans le gène coxII, ce qui provoque le décalage du cadre de lecture de -1 à bon cadre de lecture.

Question 54

Vrai ou faux? L’édition de l’ARN par insertion de U ne se passe pas chez les humains.

Answer 54

Vrai.

Question 55

À quoi servent les ARN guides (ARNg) dans l’édition de l’ARN par insertion de U?

Answer 55

Les ARN guides (ARNg) servent à l’insertion de U. Leur longueur est de 40-80 nucléotides.

Ils comportent 3 régions:
– Extrémité 5’ = ancrage, dirige l’ARNg vers la région de l’ARNm à éditer
– Région d’édition = région déterminant la position d’insertion des U
– Extrémité 3’ = région poly-U (son rôle n’est pas clair)

Question 56

Quel est le mécanisme d’édition de l’ARN par insertion de U?

Answer 56

Appariement de la région d’ancrage

A non apparié où les U seront insérés

Coupure par une endonucléase dans les régions d’ARN mésappariées

Transfert de U dans les interruptions de l’ARNm

Ligation

Question 57

Les ARNm matures représentent quel % des ARN dans le noyau? Qu’est-ce que cela indique?

Answer 57

Les ARNm matures représentent 1-5% des ARN dans le noyau.

Cela indique qu’ils sont rapidement exportés.

Question 58

Lorsque l’ARNm est mature où doit-il aller? De quelle façon?

Answer 58

Lorsque l’ARNm est mature, il doit être transporté hors du noyau pour être traduit en protéine (voir avec C. Salesse). Le transport de l’ARNm du noyau vers le cytoplasme est un procédé non passif

Question 59

Comment se fait la sélection des bons ARNm à transporter?

Answer 59

Certaines protéines favorisent le transport
– Ex. les protéines SR (régulateurs de l’épissage) restent associées à l’ARNm suite à l’épissage et favorisent leur transport

Certaines protéines inhibent le transport
– Ex. Les protéines liées aux jonctions entre les introns (snRNP)

Question 60

L’exportation des ARNm se fait à l’aide de quelle structure?

Answer 60

L’exportation se fait via une structure particulière de la membrane nucléaire (pores) qui permet le passage de molécules < 50 kDa.

Question 61

Quelles sont les 3 étapes de la maturation de l’ARN?

Answer 61

– Addition de la coiffe
– Épissage
– Polyadénylation