Epigenetik Flashcards
Klausur 1,0
Was macht die Peloria Mutante von Linaria vulgaris (echtes Leinkraut) besonders?
- Mutation in Methylierungsmuster des Lcyc Gen
- Stark methyliert und Transkription unterdrückt
- Keine klassische genetische Mutation der DNA Sequenz
- Phänotyp ist radialsymmetrisch statt bilateral
Paper: An epigenetic mutation
responsible for natural
variation in floral symmetry
Erläutern Sie wie das Muster der Calico cat (Schildpatt Katze) zustande kommt. Auf welchen epigenetischen Prinzipien basiert es?
- Tritt bei weiblichen Katzen auf
- Fellfarbe ist X-Chromosomaler kodominanter Erbgang (schwarz/rot)
- Bei heterozygoten Katzen tritt eine Mosaikmusterung auf, die nicht genetisch determiniert ist
- X-Chromosom Inaktivierung in der Embryonalentwicklung ist zufällig (Stochastische Inaktivierung)
- Die Inaktivierung wird an die Tochterzellen weitervererbt, dadurch Regionen einer Fellfarbe im adulten Tier (Klonale Vererbung)
Zusatz:
- Bei Klonung einer Katze aus einer Zelle, bleibt die jeweilige Inaktivierung bestehen. Somit einfarbiges Fell
- Bei männlichen Katzen ist dieses Fellmuster z.B. über Klinefelter-Syndrom (XXY) erklärbar. Diese Katzen sind allerdings unfruchtbar
Definieren Sie Epigenetik
- Vererbbare Phänomene in der Genfunktion (mitotisch und/oder meiotisch), die nicht durch Veränderungen in der DNA Sequenz erklärt werden können
- Chemische Grundlage: Veränderungen am Chromatin, DNA-bindende Proteine oder DNA-Methylierung
Vergleichen Sie Genetik und Epigenetik
- Genetik: Bestimmt durch DNA-Sequenz
- Mutationen treten bei Basen auf. Wenn in Keimbahn, dann vererbbar
- Epigenetik: Liefert Erklärung für Zelldifferenzierung oder paternale/maternale Vererbung (Imprinting)
- Mutationen treten bei der Modifikation der DNA und der assozierten Proteine auf
- Epigenetische Änderungen sind umkehrbar, Genetische nicht
Was versteht man unter “epigenetic landscape” (Conrad Waddington)?
- Ein Genom, viele Epigenome (Zelldifferenzierung)
- Theoretisch möglich: Differenzierung aufheben und Zelltypen ineinander umwandeln
- Epigenetisch ähnliche Zelltypen wären dabei leichter umwandelbar
Nennen Sie writer für 1) Acetyl-Lysin 2) Serin/Threonin-Phosphat 3) Methyl-Argenin 4) Methyl-Lysin
1) Histon-Acetyl-Transferase (HAT)
2) Kinase
3) Protein arginine Methyltransferase (PRMT)
4) Lysin(K) Methyl-Transferase (KMT)
Nennen Sie reader für 1) Acetyl-Lysin 2) Serin/Threonin-Phosphat 3) Methyl-Argenin 4) Methyl-Lysin
1) Bromo-Domain
2) SANT-Domain
3) Tudor-Domain
4) Chromo-Domain
Nennen Sie eraser für 1) Acetyl-Lysin 2) Serin/Threonin-Phosphat 3) Methyl-Argenin 4) Methyl-Lysin
1) Histon-Deacetylase (HDAC)
2) PPTase
3) protein arginine deiminases (PAD)
- ändert aber die Aminosäure (zu Citrullin)
4) Lysin(K) Demethylase (KDM)
- Aminoxidase oder Hydroxylase
Nennen Sie 3 epigenetische Mechanismen
1) chemische Modifikation der Histone (posttranskriptional)
2) Modifikation der DNA (z.B. Methylierung)
3) Verschiebung der Nukleosomenposition (Chromatinremodeling)
Beschreiben Sie die Zusammensetzung eines Histon-Oktamers.
- Besteht aus H2A,H2B,H3 und H4 Untereinheiten
- H2A/H2B bilden Dimere
- H3/H4 Tetramere
- 2x H2A/H2B + 2x H3/H4 bildet Histon Oktamer
- zusammen mit 147 bp DNA -> Nukleosom
Beschreiben Sie den Aufbau des Nukleosoms.
Was ist die Dyad Achse?
- Histon-Oktamer + 147 bp DNA
- 2 Umwicklungen der DNA (links rum) um das Histon-Oktamer
- H3/H4 oben
- H2A/H2B unten
-Dyad-Achse: Ein- und Austrittsstelle der DNA am Histon-Oktamer
Was ist die Rolle von H1?
- Linker Histon
- Basenpaar länge (147) um Histonoktamer bleibt unverändert
- Linkerlänge (Abstand zum nächsten Nukleosom=Linker DNA) ändert sich
- Dadurch kompaktere Packung -> 30nm Struktur des Chromatins
Wie beeinflusst H1 die Chromatin Struktur? Welche Extratkionsformen gibt es?
- H1 anwesend: 30nm Struktur (Niedersalz-Extraktion)
- H1 abwesend: 10nm Struktur (Hochsalz-Extraktion)
Was ist die Histon-fold domain? Was lässt sich über das C- und N-Terminale Ende aussagen?
- Histon-fold domain: eine kurze, eine lange, eine kurze Alpha Helix.
- diese greifen ineinander um Quartärstruktur zu bilden
- C- und N-Terminales Ende sind flexibel. Sowohl räumlich als auch im Bezug auf die länge zu anderen Untereinheiten
Erläutern Sie die Unterschiede zwischen DNAse und MNAse. Welche Rolle spielt hier der limitierte Verdau?
- DNAse: Sensitive Stelle für DNA ohne Chromatin (Nachweis für Transkriptionsfaktoren)
- MNase (Micrococcal nuclease): Sensitive Stelle für Linker-DNA (Nachweis für Histonpositionen)
-Limitierter Verdau: Sensitive Stellen werden zuerst verdaut
Nennen Sie signifikante Eigenschaften des Heterochromatins.
- Dichter (starke Anfärbung)
- Wenig Genexpression
- Genarm
- Bindung von Heterochromatinproteinen (HP-1,SIR2/3/4)
- Hypoacetyliert (wenig)
- Konstitutives Heterochromatin: H3K9 Me
- Fakultatives Heterochromatin: H3K27 Me
Nennen Sie signifikante Eigenschaften des Euchromatins.
- Locker (schwache Anfärbung)
- Gute Genexpression
- Genreich
- Hyperacetyliert (viel)
Nennen Sie chemische Modifikationen die an Histonen auftreten. Wo treten diese vorwiegend auf?
- Acylierung (R-C=O)
- Acetylierung an Lysin (CH3-C=O)
- Methylierung an Lysin und Arginin
- Phosphorylierung
- Ubiquitinierung/Sumoylierung (kleine Proteine)
-Treten am großteils am N-Terminus auf
Was lässt sich über die Aminosäure-Sequenz und die Modifikationen der Histone aussagen?
Sind extrem stark konserviert
Wodurch werden die Modifikationen vorgenommen, die für die Transkription nötig sind?
- SAGA Komplex
- Enthält:
1) Histon Acetyltransferase
2) Deubiqutinierung
3) Faktoren die mit TATA-Box Proteinen interagieren - Wichtig für die Transkription
- Auch wichtig für export der mRNA
Nennen Sie ATP abhängige Chromatin remodler. Welche Funktionen übernehmen diese?
1) SWR1-Komplex:
- enthält Protein aus der SWI/SNF Familie (Swr1)
- katalysiert den austausch von Histonvarianten (H2AZ-H2B Dimere)
2) NuA4/Tip60-Komplex:
- Histon Modifikation
- Histonacetylase Funktion (mit ATP und Acetyl-CoA)
3) INO80-Komplex:
- Chromatinremodler; verschiebt Nukleosomen
Funktion: DNA Reparatur, Zellzyklus/Replikation, Genregulation
Was bedeutet “cross talk” und “cross tail”?
Cross talk:
-Modifikationen in direkter Nachbarschaft beeinflussen sich (sterische Hinderung)
Cross tail:
-Modifikation an einem N-Terminus beeinflusst ein Modifikation am N-Terminus einer anderen Histonuntereinheit (“unintuitiv”)
Wie funktioniert die Lysin Acetylierung? Wie ist die Notation?
-Durch HistonAcetylTransferase (HAT)
-Acetyl-CoA liefert Acetylgruppe
-Acetyl am epsilon-Ende des Lysins
-Positive Ladung geht verloren, da NH3+ nicht mehr vorhanden
Notation: H3K5,8,12 Ac (Histonuntereinheit 3 ist an den Lysin mit Position 5,8 und 12 acetyliert)
Nennen Sie die HAT Familien. Wie werden diese klassifiziert?
-Klassifikation nach Homologie
1) HAT1: H4K5,12 Ac
-direkt nach Synthese im Cytoplasma
2) Gcn5/PCAF:
Gcn5: vorwiegend H3 Acetylierung, etwas H2B
-Acetylierung in Nähe des Promotors
-Teil des SAGA-Komplexs (Transkriptionsaktivatorkomplex)
3) MYST: H4 Ac
MOF: H4K16 Ac
-Dosis-kompensationskomplex in Drosophila
Ybf2,Sas3:
-Teil von NuA3
-Transkriptionsaktivierung
Tip60:
-Teil eines Komplexes mit HAT Aktivität
-Chromatin remodeling
4) p300/CBP: H3 und H4 Ac
CBP = CREB-binding protein
CREB = cAMP response element binding protein
-Nur bei Tieren, aber strukturelle Homologie zu Rtt109
5) Rtt109: H3K56 Ac
-Nur in Pilzen (gibt diese Modifikation somit auch nur in Pilzen)
-keine Primärsequenzhomologie
Was lässt sich über die Struktur der HATs aussagen?
- Acetyl-CoA sitz als Cofaktor im Zentrum
- Beta Sheets aus 3 Strängen + alpha Helix
- Strukturelle Ähnlichkeiten aber keine direkte Homologie
Was ist das Problem mit HAT Inhibitoren?
- sind nicht selektiv ->Nebenwirkungen
- wirken nur bei hohen Konzentrationen
- nicht wirklich therapeutisch geeignet
- > Es gibt Inhibitoren aber keine Medikamente
Nennen Sie Mechanismen und Funktion der Histonacetylierung.
Mechanismus:
- Elektrostatische Wechselwirkung
- Spezifität des Readers zum Acetyl ->erhöhte Affinität der Bindung
- Reader sind Teil von Proteinkomplexen, daruch Funktion vermittelt
Funktion:
- Transkriptionsaktivierung
- Replikation
- DNA-Reparatur
- Histon-Import in Zellkern (HAT1)
Was ist der Reader der Histonacetylierung (Lysin)? Was lässt sich über die Inhibitoren im vergleich zu den HAT-Inhibitoren aussagen?
- Bromodomain, besteht aus tandem repeats
- Acetyl-Lysin Bindestelle
- 56 verschiedene Bromodomainen beim Menschen
- Inhibitoren zwischen Bromodomain und Bindepartner sind selektiver -> weniger Nebenwirkung
Welche Histon-Acylierungen können auftreten? Was sind Writer, Reader und Eraser?
1) Propionyl
2) Crotonyl
3) Succinyl
4) Malonyl
- Acylierungen treten seltener auf auf Acetylierung
- Reader sind Acetylation-Reader: BRD, (YEATS, Double PHD, Double PH, non canonical BRD)
- Writer sind Acetyltransferasen (mit Co-Faktor = Acyl-CoA)
- Eraser: Deacetylasen können auch deacylieren
Nennen Sie Klassen von Histondeacetylasen. Was lässt sich über die Inhibitoren aussagen?
1) Class I - Rpd3 like
2) Class II - Hda1 like
3) Class III - Sir2 like (Sirtuin 2)
- Sirtuin: NAD+ abhängige Histondeacetylase. Teil des SIR 2/3/4 Heterochromatin Komplexes. SIR-Komplex -> Silencer Komplex
4) Class IV - HDAC 11
(Klassen I,II und IV sind ähnlich)
- HDAC Inhibitoren:
- In geringer Dosis wirksam. Bereits klinische Anwendung
- Sirtuin Inhibitoren:
- Chemische verschieden von HDAC Inhbitoren.
- In Testphase für Krebstherapien
Wie funktioniert die Genaktivierung? Was bedeutet Feedback?
- Durch Nukleosomverschiebung und Acetylierung
- An UAS (upstream activator sequence) binden Transkriptionsaktivator -> rekrutiert HAT
- Acetylierung sorgt für “auflockerung” des Chromatins, da positive Ladung entfernt (experimentell nur für eine Stelle bestätigt)
- Acetylierung kann von Bromodomainen erkannt werden, diese sind oft Teil von großen Komplexen mit Auswirkungen auf das Chromatin
- Bindung von RNA Polymerase II ermöglicht
- Diese Hilft bei Rekrutierung von Methyltransferase (Set1 und Set2)
- H3K4Me3 (durch Set1, in Promotornähe) wirkt Transkriptionsaktivierend
- H3K36Me (durch Set2, gesamter ORF) wichtig für Elongation
Feedback: Stellt den urspünglichen Zustand des Chromatins nach der Transkription wieder her
Wie funktioniert die Genrepression?
- An URS (upstream repressive sequence) binden Transkriptionsrepressoren -> rekrutiert HDAC (z.B. Rpd3)
- HDAC sind Teil von Proteinkomplexen, welche dann repressiv auf die Transkription wirken
- Rpd3 besitzt außerdem Chromodomain die an ORF (open reading frame) bindet, wenn dieser als H3K36Me vorliegt
- Unterdrückt Initation der RNA Polymerase II
- > Verhindert somit, dass Transkription in mitten des ORF startet
Welche Histonmethylierungen können auftreten? Was sind unterschiede zur Histonacetylierung?
Lysin-Methylierung: mono-, di-, tri- -Positive Ladung geht hier nicht verloren Arginin-Methylierung: mono-, di-
-Acetylierung wirkt allgemein aktivierend auf Genexpression, Methylierung hat unterschiedliche Folgen je nach Methylierungsstelle
Was sind die Writer der Histonmethylierung?
- Histonmethyltransferasen (HMT):
1) SET
2) Dot1
Was sind typische stellen der Histonmethylierung. Durch welche Enzyme werden sie vermittelt und welche Funktion folgt daraus?
1) H3K4 durch Set1: Me3: Transkriptionsinitation im 5'-Bereich des Gens (Promotornähe) Me1: Enhancer Me1 + H3K27Ac: Aktive Enhancer 2) H3K36Me3 durch Set2: - Transkriptionselongation 3) H3K79 durch Dot: -Verhindert Heterochromatin 4) H4K20 durch Set7: Me1: wirkt aktivierend Me3: wirkt repremierend 5) H3K9Me durch Suv39: -Repression -Konstitutives Heterochromatin 6) H3K27Me3 durch Ezh2/Polycomb: -Aufrechterhaltung der Repression (z.B. Hox-Gene) -Fakultatives Heterochromatin
-> Keine einheitliche Wirkung der Methylierung
Was ist fakultatives und konstitutives Heterochromatin?
Fakultatives Heterchromatin:
-Nur in einige Zellen des Organsimus (z.B. X-Chromosom Inaktivierung)
Konstitutives Heterchromatin:
-In allen Zellen des Organsimus an der gleichen Stelle gebildet (z.B. am Zentromer oder Telomer)
Welche Typen von Arginin-Methylierung gibt es?
-Mono-Methyl Arginin
-Di-Methyl Arginin:
symmetrisch (dursch PRMT Klasse I) oder antisymmetrisch (durch PRMT Klasse II)
Wie wird Lysin demethyliert? Was sind die Substrate?
1) Oxidation durch Aminoxidase (hier: LSD = Lysine specific demethylase)
Substrat: -Me2, -Me1
-Oxidation geschiet durch Einführung einer Doppelbindung. Daher -Me3 nicht möglich, da Stickstoff 5 Bindungen haben würde
2) Hydroxylierung durch Jumonji domain protein
Substrat: -Me3, -Me2, -Me1
Wie wird Tri-methylierung erkannt?
PHD-Finger (H3K4Me3-> Transkriptionsinitation)
-Meist Lysin Methylierung kann aber auch zum Teil Mono- und Dimehtyl-Arginin
Wie bindet SIR3 an das Nukleosom? Wann bindet es nicht?
- Über die BAH (bromo-adjacent homology)-Domain
- Bindet an Nukleosom und Histon-N-Terminus
- Bindet nicht bei H4K16Ac oder H3K79Me
Nennen Sie Methyl-Lysin bindende Module. (Reader)
1) Chromodomain
- HP1: H3K9Me binden (konstitutives Heterochromatin)
- Polycomb: H3K27Me (fakultatives Heterochromatin)
- MSL3: H4K20Me1 (Teil von Dcc in Drosophila)
- Eaf3: H3K36Me (Teil von Rpd3-Komplex = HDAC)
2) Tudordomain
3) PWWP-Domain (Pro-Trp-Trp-Pro)
4) PHD-Finger (Meist Lysin manchmal Arginin)
Wie erfolgt die Arginin Demethylierung?
1) Umwandlung in andere Aminosäure (Citrullin) durch PADI4 (Peptidyl arginine deiminase, type IV)
2) Manche Jumonji Proteine können auch Arigin demethylieren
Warum spricht man von koordinierten Chromatin Modifikationen?
- Da sich die Modifikationen untereinander beeinflussen
- Können inhibierende oder begünstigende Wirkung haben
Erläutern Sie das Prinzip von ChIP.
- ChIP = Chromatin Immunpräzipitation
- Nachweis von Interaktion bestimmer Proteinen mit der DNA (an welche Sequenz diese Proteine binden)
1) Crosslink mit Formaldehyd (Kovalente Bindung von Protein mit DNA)
2) Chromatinschere -> Kürzere Segmente des Chromatins
3) Antikörper mit “magnetic beads” die spezifisch für das jeweilige Protein sind -> Extraktion des Proteins - Nutze Kontrolle um Refrenzwert zu haben, was sowieso extrahiert werden würde
4) Reverse Crosslink
5) DNA Isolierung
6) Analyse mit: - qPCR (Fluoreszenzkurve)
- ChIP on Chip: Hybridisierung mit Microarray
- ChIP-Seq: ganzes Genom, weniger Hintergrundrauschen, bessere Auflösung, Sequenzierung und Alignment
Was sind Unterschiede zwischen ChIP-qPCR, ChIP on Chip und ChIP-Seq?
1) qPCR = quantitative PCR (Analyse während aller Reaktionsschritte)
- Nutzt entsprechende Primer
- Fluoresezenz verursacht durch Marker der in dsDNA interkaliert (Signal verstärkt)
- Somit Fluoresenzenz Signal proportional zum Fortschritt der PCR Reaktion
- Ct-Wert (Cycle Threshold): Gibt an, nach wieviele Zyklen das Signal über Hintergrundrauschen steigt
- Ct-Werte können verglichen werden, liefern Auskunft über die Anfangskonzentration der Probe (weniger Zyklen nötig, wenn Anfangskonzentration hoch)
2) Microarray
- Nur teile des Genoms
- Fluoreszenzsmarkierung
- DNA Fragmente binden an bekannte Sequenzen des Microarrays
- Färbung des Microarrays nach waschen
- Geringe Kosten
- Schnelle und einfache Analyse
- Dafür schlechtere Auflösung und mehr Hintergrundsignal als ChIP-Seq
3) Sequenzierung generiert “Reads”
- Ganzes Genom
- Base calling aus Bilddaten
- Aligment der Reads auf bekanntes Genom
- “Peak-calling” (Statistische Analyse; was ist ein echtes Signal?)
- Computermodellierung/-auswertung
Welche erweiterenden Analysmethoden gibt es zu ChIP?
1) MNAse-Seq: Peaks an den Stellen, wo sich Nukleosomen befanden
2) DNAse-Seq: Peaks and den Stellen, wo sich freies Chromatin befand
3) Chromosome conformation capture (3C)
- 4C: circular Chromosome conformation capture
- 5C/HiC
Erläutern Sie die unterschiedlichen Typen 3C, 4C, 5C und HiC.
Prinzip: Welche Loci liegen im 3D Raum nah beieinander, sind aber genomisch weit entfernt?
- Grund hierfür z.B. Promotor-Enhancer Interaktion
- Methoden unterscheiden sich darin, wieviele Teile sie miteinander vergleichen
Generelle Methodik:
- Chromatin Crosslinken (z.B. Formaldehyd)
- Schneiden mit Restriktionsenzym
- Ligation
- Verdau der DNA
- Reverse Crosslink
3C - chromosome conformation capture (one vs one):
-quantitative PCR mit bekannten Primern
4C - circular chromosome conformation capture(one vs all):
-Zweiter Ligationsschritt erzeugt Zirkuläres Segment
-Inverese PCR
-Microarray oder Sequenzierung
5C - Chromosome conformation capture carbon copy (many vs many):
-Ligation von universellen Primern
-PCR
-Geringer Anwendungsbereich
-Microarray oder Sequenzierung
HiC (all vs all):
-Enden auffüllen mit Biotin
-DNA Extraktion über Biotin pulldown (mit streptavidin)
-Hochdurchsatzsequenzierung
Was sind TADs?
Topologically associated domains
- Chromosomen liegen in Territorien vor
- Selbst interagierende genomische Regionen
- Sequenzen innerhalb einer TAD interagieren häufiger miteinander (Trennung durch TAD Boundaries)
- Es gibt aktive und repremierende Regionen (Eu- und Heterochromatin)
- Heterochromatin viel am Rand
- Euchromatische Regionen nehmen mehr Platz ein
- Somit nimmt aktives X-Chromosom bei weibchlichen Säugern mehr Platz ein als das inaktive
- Wichtig für Enhancerinteraktion (große genomische Distanz, aber räumlich nah beieinander)
Welche Fabriken gibt es im Zellkern? Was ist hierbei das Prinzip?
Transkriptionsfabriken, Replikationsfabriken und Reparaturfabriken
-Die entsprechenden Enzyme liegen akkumuliert vor und die DNA wird “durchgezogen”
Was sind Histon-Varianten? Welche gibt es?
-Sind Homologe zu Histonen (von eigenem Genom)
H3:
-CENP-A (zentromerische H3 Variante)
-wichtig für Bildung des Zentromers und Chromosomenseparation in Zellteilung
-H3.3: bei aktiver Transkription eingebaut
-H3.1: bei Replikation eingebaut
H2A:
-macro H2A: an inaktivem X-Chromosom
-H2A-Bbd (Barr-body-deficient): Aktives X-Chromosom und Autosomen
-H2A.X: Phosphorylierung bei DNA-Schäden. Wichtig für Reparatur
-H2A.Z: an -1/+1 Nukleosom um TSS (TranskriptionsStartStelle)
Was lässt sich über die Orientierung der Basen am Histon aussagen? Was über die Promotorregion?
G-C reiche Region: Außenseite des Nukleosoms
A-T reiche Region: Innenseite des Nukleosoms
- Abwechselnd AT/GC ->Nukleosompositionierung
- AT-Strechtes -> nucleosome depleted region (NDR)
Promotor-Region (AT reich): Großteils frei von Histonen
Was lässt sich über die Positionierung der Histone um die TSS aussagen?
TSS = TranskriptionsStartStelle
(Messung der Nukleosompeaks über MNase Seq)
+1 Nukleosom, nach Promotor genau positioniert
-1 Nukleosom weniger genau positioniert
-1,0,+1 Nukleosom sind durch DNA Sequenz vorgegeben
alle weiteren +2,+3,+4… durch Zelluläre Faktoren vorgeben (keine Messung in vitro)
an -1/+1 Mischung auf H2A und H2A.Z
Welche expliziten Aufgaben übernehmen Chromatin Remodler? Was haben diese gemeinsam?
- Besitzen alle ATPase Domain
1) Nukleosom sliding
2) Histon exchange
3) Nukleosom eviction
4) Nukleosom assemby
5) Nukleosom spacing
Nennen Sie Arten von Chromatin Remodlern. Welche Auswirkungen haben sie auf die Nukleosomenposition um die TSS?
1) Swi2/Snf2 like (switch/sucrose-non-fermenting)
- ein Gen
2) ISwi (imitation switch)
3) RSC (remodels structure of chromatin)
4) CHD (chromodomain)
5) Ino80
- Ino80 Komplex
- Swr1 Komplex (H2A.Z austausch)
- Meiste Remodler Teil von großen Komplexen mit weiteren Auswirkungen auf das Chromatin
- Chromatin Remodler Komplexe legen die Position von +2,+3,+4,… Nukleosomen in vivo fest
Wie entsteht die Komplexität eines Organismus?
Nicht durch Anzahl der Gene sondern verschiedene Möglichkeiten der Genexpression
Vergleichen Sie Prokaryoten und Eukaryoten in Hinsicht auf die Komplexität der Genexpression
Prokaryoten:
-Promotor und davor Aktivator oder Silencer
Eukaryoten:
- Promotor selbst komplexer
- Enhancer (upstream, downstream, distal, proximal)
- > Unterschiedliche Ergebnisse in Aktivität
Nennen Sie die Auswirkungen von Methylierungen an den entsprechenden Stellen.
- H3K27Me3: fakultatives Heterochromatin (Ezh2/Polycomb)
- H3K9Me: konstitutives Heterochromatin (Suv39)
- H3K36Me3: aktive Transkription (Set2)
- H3K4Me1 + H3K27Ac: Aktive Enhancer (p300)
- H3K4Me1: Enhancer
- H3K4Me3: Aktive Promotoren (Set1)
Was sind “even skipped (eve) genes”? Wie werden sie reguliert?
- Segmentierungsgene im Drosophila Embryo
- Jeweilige Enhancer verursachen Expression einer bestimmten mRNA im jeweiligen Segment -> Proteine in diesem Segment
- Segementierung entspricht nicht reinfolge auf dem Genom
Erläutern Sie die Prozedur von Sanger Sequencing.
Was sind Vor- und Nachteile?
1) DNA fragmentieren
2) Fragmente in Plasmid aufnehmen und Amplifikation in Bakterien
3) PCR mit dNTPs und ddNTPs, welche Reaktion beim Einbau stoppen (Hydroxygruppe fehlt; Einbau zufällig)
- Für jede Base ein ddNTP mit Fluorophor (unterschiedliche Emission)
- > PCR Produkte mit unterschiedlicher Länge
4) Anordnung der PCR nach Länge und Sequenzbestimmung aus Farbe
- Aufwendig und langsam, dafür künstig
Erläutern Sie die Prozedur von Next Generation Sequencing. Was sind Vor- und Nachteile?
1) DNA fragmentieren
2) Ligation von Adaptoren
3) Adaptoren binden durch Komplementäre Basenpaarung in einer Region
4) Mehrere PCR Zyklen sorgen für Amplifikation eines DNA Fragments im jeweiliger Region
5) Zyklisches einbauen von Nukleotiden mit Fluorphor (immer nur ein Nukleotid, dann Messung der Emission)
6) Unterschiedliche Regionen emittieren dann Licht was zu einer Base korrespondiert (Base calling)
7) Wiederholung der Zyklen für Sequenz der Fragmente
8) Software fügt überlappende Segmente zusammen für gesamte Genomsequenz
Vorteile:
- Keine Klonierung nötig
- Schnelle Sequenzierung
Nachteile:
- kurze Fragmente (50-300 bp), daher Referenz Genom nötig
- Teures Equipment nötig
Wie unterscheidet sich Third Generation Sequencing von NGS?
- Nutzt keine PCR
- Längere Reads (5-20kb)
- Dafür ungenauer
- Kombination von beiden. TGS für Kontext und NGS für Genauigkeit
Wie tritt DNA Methylierung auf?
- Als 5-methyl-Cytosin (Kurz: m5c oder 5mc)
- Meist beide Stränge methyliert
Was sind Writer der DNA Methylierung? Was sind ihre Funktionen?
DNA methyl transferasen (Dnmt)
1) Dnmt1: Maintance Methylierung
- Aufrechterhaltung der Methylierung, da bei Replikation nur Standardbasen eingebaut (sonst “Verdünnung” der Methylierung)
- PCNA-Domain: bindet an PCNA (Ringklemmen)-Protein, das die DNA während der Replikation umgibt
2) Dnmt2: (tRNA- Methyltransferase)
3) Dnmt3a: de novo Methylierung
- PWWP-Domain bindet H3K36Me2/3
4) Dnmt3b: de novo Methylierung
Was sind Eraser der DNA Methylierung? (Demethylierung)
1) Passiver Verlust der DNA Methylierung duch DNA-Replikation (Bezogen auf Zellpopulation)
2) TET-Enzyme (Ten-eleven-translokation)
-Katlysieren 5mC zu 5hmC zu 5fC zu 5caC
(Methylcytosin zu Hydroxymethylcytosin zu Formylcytosin zu Carboxylcytosin)
-5-Formylcytosin und 5-Carboxycytosin werden als DNA-Schaden erkannt
-Durch TDG (Thymin-DNA-Glykosylase) rausgeschnitten
-Über Basenextinktion Reparatur ersetzt
-Somit wieder Cytosin
3) Hydrolytische Desaminierung
-5mC->Thymin
-Hier besteht 50%/50% Chance, dass C oder A erstezt wird
-Wenn A eingebaut wird, ist eine Mutation aufgetreten
Hingegen wird Cytosin->Uracil und dann immer durch C ersetzt, da U nicht in DNA auftritt
Erläutern Sie den Prozess der Bisulfit Behandlung? Wozu wird es genutzt?
Anwendung:
- DNA-Bisulfit-Sequenzierung
- Herausfinden, welche Stellen in der DNA methyliert vorliegen
Prozess:
-Bisulfit Reagenz ändertz C->U, wohingegen 5mc und 5hmc unverändert bleiben (Bisulfitkonvertierung)
-PCR-> U aus DNA wird zu T. 5mC werden zu C (nur Standardbasen eingebaut)
-Direkte Sequenzierung (Hochdurchsatz/NGS)
oder Subklonierung (nur 1 Molekül eingebaut->keine Überlagerung von C und T Peaks bei Sequenzierung) und anschließend Sanger-Sequenzierung
Was sind CpG-Inseln? Was lässt sich hier über die Methylierung aussagen?
CpG-Inseln: Region mit hohem vorkommen an CpG-Dinukleotiden
- Liegen meist unmethyliert vor
- Hingegen sind die CpG-Dinukleotide meist methyliert
- Wenn CpG Insel am Promotor, wird Gen nur exprimiert, wenn dieser unmethyliert vorliegt
Was sind Probleme bei der “Whole Genome” Bisulfit Sequenzierung?
- Bei kleiner Methylierungsrate, ist es Fehleranfällig
- Bisulfitkonvertierung erfolgt nicht mit 100% Effizienz
- Kein Aussage möglich, ob Methylierung oder Hydroxymethlierung vorlag
Nennen Sie weitere Möglichkeiten um Methylierung der DNA nachzuweisen. (Außer Bisulfitkonvertierung)
1) Me-DIP = Methyl-DNA-Immunopräzipitation
- MeDIP-Chip (Microarray) oder MeDIP-Seq (Hochdurchsatz)
- Antikörper gegen 5mC
- Hier aber auch Problem: Müsste 5mC von 5hmC unterscheiden können. Ist nicht 100% akkurat
2) HPLC/MS (Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung)
3) Methylierungssensitive Restriktionsenzyme